Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis
Summary
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.
Abstract
Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch die Kombination von Umweltfaktoren und empfänglichem genetischen Hintergrund verursacht wird. Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) ist ein typisches Krankheitsmodell von MS, das weit verbreitet ist, um die Pathogenese zu untersuchen, bei der T-Lymphozyten, die speziell für Myelin-Antigene sind, eine Entzündungsreaktion bei ZNS auslösen. Es ist sehr wichtig zu beurteilen, wie Lymphozyten im ZNS die Entwicklung von Krankheiten regulieren. Der Ansatz zur Messung der Menge und Qualität infiltrierter Lymphozyten im ZNS ist jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der Isolierung und Detektion infiltrierter Lymphozyten aus dem Gehirn sehr begrenzt. Dieses Manuskript enthält ein Protokoll, das für die Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung infiltrierter Lymphozyten aus dem ZNS nützlich ist und hilfreich für unser Verständnis der Rolle der Lymphozyten bei der Entwicklung der CNS-Autoimmunerkrankung sein wird.
Introduction
Als chronische demyelinisierende Erkrankung des ZNS betrifft MS etwa 2,5 Millionen Menschen weltweit und es fehlt an kurativen Behandlungen1. Es gilt auch als eine Autoimmunerkrankung, bei der Myelin-Antigen-spezifische T-Lymphozyten eine Entzündungsreaktion auslösen und zu Demyelination und Axonalverletzungen im ZNS2führen. Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) wurde weit verbreitet verwendet, um pathogene Mechanismen von MS als klassisches Autoimmun-Demyelination-Krankheitsmodell in CNS3zu untersuchen. Es gibt zwei Möglichkeiten, EAE zu induzieren: eine besteht darin, EAE aktiv durch Immunisierung von Tieren mit Myelinkomponenten zu induzieren, eine andere ist der Adoptivtransfer durch Übertragung enzephalitogener T-Zellen in Rezeptor2,4,5. Die Anfälligkeit für EAE unterscheidet sich in verschiedenen Tierstämmen6. Bei C57BL/6-Mäusen induziert Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35–55-Herausforderung eine monophasische Erkrankung mit umfangreicher Demyelination und Entzündung im ZNS, die häufig in Experimenten mit gengezielten Mäusen verwendet wird7.
Die Erzeugung von Myelin-spezifischen reaktiven T-Zellen ist für das Auftreten und die Entwicklung von Krankheiten bei EAE erforderlich und ist ein immunologisches Zeichen von EAE und MS. Aktivierte autoreaktive T-Lymphozyten überqueren die Blut-Hirn-Schranke (BBB) in das gesunde ZNS und initiieren EAE-Krankheit. Wenn MOG 35–55 Ag angetroffen wird, induzieren diese T-Lymphozyten Entzündungen und die Rekrutierung von Effektorzellen in das ZNS, was zu Demyelination und Axonzerstörung8,9führt. Im EAE-Modell gibt es genügend Hinweise darauf, dass neuroantigenspezifische CD4+ T-Zellen Neuroinflammation und Pathologie3,10initiieren und aufrecht erhalten können. Je nach den wichtigsten produzierten Zytokinen wurden CD4+ T-Lymphozyten in verschiedene Teilmengen eingeteilt: Th1 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interferon-γ), Th2 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 4) und Th17 (gekennzeichnet durch die Produktion von Interleukin 17). Es wird angenommen, dass die Aktivierung von Th1- und Th17-Zellen zur Induktion, Wartung und Regulierung der entzündlichen Demyelination bei EAE und MS beiträgt, indem sie die Effektor-Zytokine IFN-γ und IL-17 sezernieren, die in der Lage sind, Makrophagen zu aktivieren und Neutrophile an den entzündlichen Stellen zu rekrutieren, um die Läsionen zu beschleunigen11.
Da autoreaktive T-Zellen die BBB in das ZNS kreuzen und die Entwicklung von Krankheiten bei MS und EAE induzieren, ist es sehr wichtig, T-Zellen im ZNS zu analysieren. Es gibt jedoch nur sehr wenige etablierte Protokolle für die Isolierung von Lymphozyten aus dem ZNS12. Daher wurde eine Methode entwickelt, die für die Isolierung mononukleantin Zellen aus dem Gehirn und die Analyse von T-Lymphozyten mit den Markern CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g und IL-17 für die Durchflusszytometrie optimiert ist. Die Methode verwendet MOG35–55 adjuvant Mycobacterium tuberculosis H37 Ra und Pertussis Toxin Working Solution (PTX), um ein aktives Immunisierungsmodell von EAE bei Mäusen zu induzieren. Anschließend werden mechanische Trenn- und Dichtegradientenzentrifugationsmethoden zur Isolierung von Mononuklezellen von ZNS eingesetzt. Schließlich wird eine optimierte Flusszytometrie-Gating-Strategie verwendet, um T-Lymphozyten und Teilmengen aus dem Gehirn zu identifizieren, indem mehrere Marker gefärbt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Induktion und Überwachung von EAE mit MOG35-55 bei C57BL/6-Mäusen, die als typisches neuroimmunologisches Versuchstiermodell von MS gelten. EAE kann induziert werden, indem die Mäusestämme oder die Art des Proteins, das für die Induktion verwendet wird, entsprechend dem Zweck der Studie variiert werden. Beispielsweise kann die Verwendung von PLP139–151 Peptid bei SJL-Mäusen einen schubförmigen EAE-Krankheitsverlauf induzieren, der besonders gut geeignet ist, um therape…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde unterstützt durch national Natural Science Foundation of China Grant (31570921 an ZJ, 81571533 to LS), Shanghai Municipal Commission of Health, and Family Planning (201540206 to ZJ), Ruijin Hospital North research grant (2017ZX01 to ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
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