Yaşlanma C. Floresan Yaşam Boyu Görüntüleme Kullanarak Elegans Amiloid Yapıların Karakterizasyonu

Protein toplama hem yaşlanma da hem de hastalıkta görülür. Büyük amiloidlerin veya amorf inklütiflerin oluşumuna ve birikmesine yol açan yolları takip etmek zordur ve kinetiklerinin çözülmesi de benzer şekilde zordur. Proteinler genetik hastalıklarda olduğu gibi kodlama sekanslarındaki içsel mutasyonlara bağlı olarak yanlış katlanabilirler. Proteinler de yanlış çünkü proteostaz ağ (PN) onları çözünür ve düzgün katlanmış tutar bozulmuş, yaşlanma sırasında olur. PN moleküler şaperonlar ve bozulma makineleri içerir ve biyogenez sorumludur, katlama, ticareti, ve proteinlerin bozulması^1.

C. elegans kısa ömrü nedeniyle yaşlanma ve hastalık çalışma modeli olarak ortaya çıkmıştır, izojenik doğa, ve genetik manipülasyon kolaylığı. Hassas dokularda insan hastalığına neden olan proteinleri ifade eden çeşitli C. elegans transgenik suşları oluşturulmuştur. Daha da önemlisi, agregasyona eğilimli proteinler içeren suşların çoğu amiloid bozukluklarının damgasını, büyük inklütiflerin oluşumunu özetler. C. elegans ‘şeffaf vücut sayesinde, bu agregalar invivo görselleştirilmiş olabilir, noninvaziv ve nondestructively². Bir florofor ile füzyon ilgi herhangi bir protein (POI) üreten yerleri, kaçakçılık, etkileşim ağı ve genel kaderi araştırmak için izin verir.

Floresan yaşam boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile yaşayan ve yaşlanan C. elegans’de hastalığa neden olan proteinlerin toplanması nın izlenmesi için bir protokol sokulmaktadır. FLIM, emisyon spektrumlarından ziyade florofor ömrüne dayanan güçlü bir tekniktir. Yaşam süresi (tau, τ) bir fotonun heyecanlı durumundan yer durumuna geri çürümek için gerekli ortalama süre olarak tanımlanır. Belirli bir molekülün ömrü zaman-ilişkili tek foton sayma (TCSPC) zaman-etki alanı tekniği ile hesaplanır. TCSPC-FLIM’de floresan bozunma fonksiyonu, kısa, yüksek frekanslı lazer darbeleri ile floroforheyecan verici ve yayılan fotonun varış sürelerinin darbelerle ilgili olarak bir dedektöre göre ölçülmesi ile elde edilir. Bir örnek tararken, her piksel için üç boyutlu bir veri dizisi oluşturulur: dizi, x,y uzamsal koordinatlarındaki fotonların dağılımı ve zamansal bozunma eğrisi hakkında bilgiler içerir. Bu nedenle verilen bir örnek, proteinin yapısı, bağlanması ve çevre^3,4. Her floresan protein, genellikle birkaç nanosaniye (ns) olan, fiziksel özelliklerine bağlı olarak içsel ve tam olarak tanımlanmış bir yaşam süresine sahiptir. Daha da önemlisi, bir florofor ömrü konsantrasyonu, floresan yoğunluğu ve görüntüleme metodolojisi bağımsızdır. Ancak, biyolojik bir sistem içinde, pH, sıcaklık, iyon konsantrasyonları, oksijen doygunluğu ve etkileşim ortakları gibi çevresel faktörlerden etkilenebilir. Yaşam ömürleri iç yapısal değişikliklere ve oryantasyona karşı da hassastır. Bir poi için bir florofor eritme ömrü nde bir değişiklik ve dolayısıyla erimiş proteinin davranışı hakkında bilgi sonuçlanır. Bir florofor, amiloid yapının antiparalel beta sayfaları gibi sıkıca bağlanmış bir ortamda çevrili veya kapsüllendiğinde, 5.⁵ Florofor un söndürülme, görünür ömrünün kısalmasıyla sonuçlanır. Çözündüğünde, bir proteinin ömrü orijinal, daha yüksek değerine daha yakın kalır. Buna karşılık, bir protein toplambaşlar, ömrü kaçınılmaz olarak daha düşük bir^değerekayacak 6^,7. Bu nedenle, yaşayan C. elegansfarklı yaşlarda herhangi bir amiloid oluşturan proteinin toplama eğilimini izlemek mümkün olur.

Burada farklı poliglutamin (CAG, Q) uzanır (Q40, Q44 ve Q85) oluşan bir füzyon proteininin agregasyon analiz etmek için bir protokol açıklar. Tekniğin siyan floresan protein (CFP), sarı floresan protein (YFP) ve monomerik kırmızı floresan protein (mRFP) gibi farklı floroforlara nasıl eşit olarak uygulanabileceğini gösteriyoruz; ve C. eleganstüm dokularda , nöronlar da dahil olmak üzere, kaslar, ve bağırsak. Ayrıca, proteostaz bağlamında, FLIM moleküler şaperonların tükenmesi üzerine değişiklikleri gözlemlemek için çok yararlı bir araçtır. RNA girişim yoluyla önemli moleküler şaperon, ısı şok proteini 1(hsp-1)yıkmak proteinlerin erken yanlış bağlanmasına neden olur. Yaşlanma, hastalık veya eksik şaperonların bir sonucu olarak toplama yükündeki artış, daha sonra floresan yaşam süresinde bir azalma olarak ölçülür.