Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков¹.

C. elegans стала моделью для изучения старения и болезней из-за его короткой продолжительности жизни, изогенной природы и простоты генетических манипуляций. Было создано несколько трансгенных штаммов C. elegans, которые выражают белки, вызывающие болезни человека, в уязвимых тканях. Важно отметить, что многие штаммы, содержащие агрегации подверженных белков резюме отличительной чертой амилоидных расстройств, формирование крупных включений. Благодаря прозрачному телу C. elegans, эти агрегаты могут быть визуализированы in vivo, неинвазивно и неразрушительно². Генерация любого белка, представляющих интерес (POI) в синтезе с фторфором позволяет исследовать его местоположение, торговлю людьми, сеть взаимодействия и общую судьбу.

Мы представляем протокол для мониторинга агрегации болезнетворных белков в жизни и старения C. elegans с помощью флуоресценции визуализации микроскопии (FLIM). FLIM является мощным методом, основанным на жизни фторфора, а не его спектры выбросов. Срок службы (тау, ) определяется как среднее время, требуемое фотоном для распада от возбужденного состояния обратно в его наземное состояние. Срок службы данной молекулы рассчитывается с помощью метода временной домены учета одного фотона (TCSPC). В TCSPC-FLIM функция флуоресцентного распада получается путем захватывающих флюорофора с короткими, высокочастотными лазерными импульсами и измерения времени прибытия испускаемого фотона на детектор по отношению к импульсам. При сканировании образца для каждого пикселя создается трехмерный массив данных: массив содержит информацию о распределении фотонов в их x,y пространственных координатах и кривой временного распада. Таким образом, данный образец становится картой жизней, раскрывающей информацию о структуре белка, связывании и окружающей среде^3,,4. Каждый флуоресцентный белок обладает внутренней и точно определенной продолжительности жизни, как правило, в несколько наносекунд (нс), в зависимости от его физиохимических свойств. Важно отметить, что срок службы флюорофора не зависит от его концентрации, флуоресцентной интенсивности и методологии визуализации. Тем не менее, в биологической системе, это может быть влияние экологических факторов, таких как рН, температура, концентрации ионов, насыщение кислородом, и его партнеров взаимодействия. Сроки службы также чувствительны к внутренним структурным изменениям и ориентации. Слияние фторофора с POI приводит к изменению в его жизни и, следовательно, информация о поведении слитого белка. Когда фторофор окружен или инкапсулирован в плотно связанной среде, такой как антипараллельные бета-листы амилоидной структуры, он теряет энергию нерадиационно, процесс, известный как закалка⁵. Утоления фторофора приводит к сокращению его очевидной жизни. Когда растворимый, срок службы белка будет оставаться ближе к его первоначальной, более высокой стоимости. В отличие от этого, когда белок начинает агрегироваться, его срок службы неизбежно перейдет к более низкому значению^6,,7. Таким образом, становится возможным контролировать склонность к агрегации любого амилоидного белка в разном возрасте в живых C. elegans.

Здесь мы описываем протокол для анализа агрегации белка синтеза, состоящего из различных полиглютамин (CAG, No) тянется (No40, No 44, и No 85). Мы иллюстрируем, как этот метод может быть применен в равной степени к различным флуоророромам, таким как циановый флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP) и мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP); и во всех тканях C. elegans, включая нейроны, мышцы и кишечник. Кроме того, в контексте протеостаза, FLIM является очень полезным инструментом для наблюдения за изменениями при истощении молекулярных сопровождающих. Сбив ая расшатывание одного из ключевых молекулярных сопровождающих, белок теплового шока 1(hsp-1),с помощью РНК-интерференции производит преждевременное искажение белков. Увеличение нагрузки агрегации в результате старения, болезни или дефицита сопровождающих, затем измеряется как снижение продолжительности жизни флуоресценции.