Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Proteinaggregation tritt sowohl im Alter als auch bei Krankheiten auf. Die Wege, die zur Bildung und Ablagerung von großen Amyloiden oder amorphen Einschlüssen führen, sind schwer zu folgen und ihre Kinetik ist ähnlich schwierig zu entwirren. Proteine können sich aufgrund intrinsischer Mutationen in ihren Codierungssequenzen falsch falten, wie im Falle genetischer Krankheiten. Proteine verrenken sich auch, weil das Proteostase-Netzwerk (PN), das sie löslich und richtig gefaltet hält, beeinträchtigt wird, wie es während des Alterns geschieht. Das PN umfasst molekulare Chaperones und Abbaumaschinen und ist verantwortlich für die Biogenese, Faltung, den Handel und den Abbau von Proteinen¹.

C. elegans hat sich als Modell zur Untersuchung von Alterung und Krankheit aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, isogenen Natur und Leichtigkeit der genetischen Manipulation herauskristallisiert. Mehrere transgene C. elegans-Stämme, die menschliche krankheitserregende Proteine in empfindlichen Geweben ausdrücken, wurden geschaffen. Wichtig ist, dass viele der Stämme, die aggregationsanfällige Proteine enthalten, das Kennzeichen von Amyloid-Störungen, der Bildung großer Einschlüsse, rekapitulieren. Dank des transparenten Körpers von C. elegans können diese Aggregate in vivo, nicht-invasiv und zerstörungsfrei visualisiert werden². Die Erzeugung von Proteinen von Interesse (POI) in der Fusion mit einem Fluorophor ermöglicht es, seine Standorte, den Menschenhandel, das Interaktionsnetzwerk und das allgemeine Schicksal zu untersuchen.

Wir präsentieren ein Protokoll zur Überwachung der Aggregation von krankheitserregenden Proteinen im lebenden und alternden C. elegans mittels Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM). FLIM ist eine leistungsstarke Technik, die auf der Lebensdauer eines Fluorophors und nicht auf seinen Emissionsspektren basiert. Die Lebensdauer (tau, b) ist definiert als die durchschnittliche Zeit, die ein Photon benötigt, um von seinem angeregten Zustand zurück in seinen Bodenzustand zu zerfallen. Die Lebensdauer eines bestimmten Moleküls wird mit der Zeit-Domänen-Technik der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) berechnet. In TCSPC-FLIM wird die fluoreszierende Zerfallsfunktion durch Das Aufregen des Fluorophors mit kurzen, hochfrequenten Laserpulsen und die Messung der Ankunftszeiten des emittierten Photons an einen Detektor in Bezug auf die Impulse erreicht. Beim Scannen eines Samples wird für jedes Pixel ein dreidimensionales Datenarray erstellt: Das Array x,y enthält Informationen über die Verteilung der Photonen in ihren xy-Raumkoordinaten und ihre zeitliche Zerfallskurve. Eine bestimmte Probe wird daher zu einer Karte der Lebensdauer, die Informationen über die Struktur, Bindung und Umgebung des Proteins^3,4enthält. Jedes fluoreszierende Protein besitzt eine intrinsische und genau definierte Lebensdauer, in der Regel von wenigen Nanosekunden (ns), abhängig von seinen physiochemischen Eigenschaften. Wichtig ist, dass die Lebensdauer eines Fluorophors unabhängig von seiner Konzentration, fluoreszierenden Intensität und der bildgebenden Methodik ist. Innerhalb eines biologischen Systems kann es jedoch durch Umweltfaktoren wie pH, Temperatur, Ionenkonzentrationen, Sauerstoffsättigung und seine Interaktionspartner beeinflusst werden. Lebenszeiten reagieren auch empfindlich auf interne strukturelle Veränderungen und Orientierung. Die Verschmelzung eines Fluorophors mit einem POI führt zu einer Änderung seiner Lebensdauer und folglich zu Informationen über das Verhalten des geschmolzenen Proteins. Wenn ein Fluorophor in einer eng gebundenen Umgebung umgeben oder gekapselt ist, wie z. B. die antiparallelen Beta-Platten einer Amyloidstruktur, verliert es Energie nicht-strahlungend, ein Prozess, der als Abschrecken⁵bekannt ist. Das Abschrecken des Fluorophors führt zu einer Verkürzung seiner scheinbaren Lebensdauer. Wenn es löslich ist, bleibt die Lebensdauer eines Proteins näher an seinem ursprünglichen, höheren Wert. Im Gegensatz dazu, wenn ein Protein beginnt zu aggregieren, wird seine Lebensdauer unweigerlich auf einen niedrigeren Wert^6,7verschieben. Daher wird es möglich, die Aggregationsneigung jedes Amyloid-bildenden Proteins in verschiedenen Altersstufen in lebenden C. eleganszu überwachen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Aggregation eines Fusionsproteins, das verschiedene Polyglutamin (CAG, Q) Dehnungen (Q40, Q44 und Q85) umfasst. Wir veranschaulichen, wie die Technik gleichermaßen auf verschiedene Fluorophore angewendet werden kann, wie Z. B. Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP) und monomeres rotes Fluoreszenzprotein (mRFP); und in allen Geweben von C. elegans, einschließlich der Neuronen, Muskeln, und der Darm. Darüber hinaus ist FLIM im Zusammenhang mit der Proteostase ein sehr nützliches Werkzeug, um Veränderungen bei der Erschöpfung molekularer Chaperonen zu beobachten. Das Abklopfen eines der wichtigsten molekularen Chaperone, das Hitzeschockprotein 1 (hsp-1), über RNA-Interferenz erzeugt eine vorzeitige Fehlfaltung von Proteinen. Die Erhöhung der Aggregationslast als Folge von Alterung, Krankheit oder mangelhaften Chaperonen wird dann als Abnahme der Fluoreszenzlebensdauer gemessen.