Karakterisering van Amyloïde Structuren in Aging C. Elegans met behulp van Fluorescentie Lifetime Imaging

Eiwitaggregatie komt zowel bij veroudering als bij ziekte voor. De paden die leiden tot de vorming en afzetting van grote amyloïden of amorfe insluitsels zijn moeilijk te volgen en hun kinetiek zijn eveneens uitdagend om te ontrafelen. Eiwitten kunnen verkeerd worden gevouwen als gevolg van intrinsieke mutaties binnen hun coderingssequenties, zoals in het geval van genetische ziekten. Eiwitten ook verkeerd vouwen omdat de proteostase netwerk (PN) dat houdt ze oplosbaar en goed gevouwen is aangetast, zoals gebeurt tijdens het ouder worden. De PN omvat moleculaire chaperonne en afbraakmachines en is verantwoordelijk voor de biogenese, vouwen, handel en afbraak van eiwitten¹.

C. elegans is ontstaan als een model om veroudering en ziekte te bestuderen als gevolg van de korte levensduur, isogene aard, en het gemak van genetische manipulatie. Verschillende C. elegans transgene stammen die menselijke ziekte-veroorzakende eiwitten uitdrukken in kwetsbare weefsels zijn gemaakt. Belangrijk is dat veel van de stammen die aggregatiegevoelige eiwitten bevatten, het kenmerk van amyloïdeaandoeningen, de vorming van grote insluitsels, samenvatten. Dankzij het transparante lichaam van C. elegans kunnen deze aggregaten in vivo, niet-invasief en niet-destructief worden gevisualiseerd². Het genereren van eiwit van belang (POI) in fusie met een fluorophore maakt het mogelijk om de locaties, mensenhandel, interactie netwerk, en het algemene lot te onderzoeken.

We presenteren een protocol om de aggregatie van ziekteveroorzakende eiwitten in levende en verouderende C. elegans via fluorescentie lifetime imaging microscopie (FLIM) te monitoren. FLIM is een krachtige techniek gebaseerd op de levensduur van een fluorophore, in plaats van de emissiespectra. De levensduur (tau, τ) wordt gedefinieerd als de gemiddelde tijd die een foton nodig heeft om te vergaan van zijn opgewonden toestand terug naar zijn grondstaat. De levensduur van een bepaald molecuul wordt berekend met de tijd-domein techniek van tijd-gecorreleerde enkele foton tellen (TCSPC). In TCSPC-FLIM wordt de fluorescerende vervalfunctie verkregen door de fluorophore op te winden met korte, hoogfrequente laserpulsen en de aankomsttijden van het uitgezonden foton te meten aan een detector met betrekking tot de pulsen. Bij het scannen van een voorbeeld wordt voor elke pixel een driedimensionale gegevensarray gemaakt: de array bevat informatie over de verdeling van de fotonen in hun x,y ruimtelijke coördinaten en hun temporele vervalcurve. Een bepaald monster wordt daarom een kaart van levens die informatie onthult over de structuur van het eiwit, binding en omgeving^3,4. Elk fluorescerend eiwit heeft een intrinsieke en nauwkeurig gedefinieerde levensduur, meestal van een paar nanoseconden (ns), afhankelijk van de fysiochemische eigenschappen. Belangrijk is dat de levensduur van een fluorophore onafhankelijk is van zijn concentratie, fluorescerende intensiteit en van de beeldvormingsmethode. Binnen een biologisch systeem kan het echter worden beïnvloed door omgevingsfactoren zoals pH, temperatuur, ionenconcentraties, zuurstofverzadiging en zijn interactiepartners. Levens zijn ook gevoelig voor interne structurele veranderingen en oriëntatie. Het smelten van een fluorophore aan een POI resulteert in een verandering in zijn levensduur en dus informatie over het gedrag van het gesmolten eiwit. Wanneer een fluorophore is omgeven of ingekapseld in een strak gebonden omgeving, zoals de antiparallelle bètabladen van een amyloïde structuur, verliest het energie niet-radiatief, een proces dat bekend staat als het blussen⁵. Het blussen van de fluoropforen resulteert in een verkorting van de schijnbare levensduur. Wanneer oplosbaar, zal de levensduur van een eiwit dichter bij zijn oorspronkelijke, hogere waarde blijven. Wanneer een eiwit zich daarentegen begint op te saggregeren, zal de levensduur ervan onvermijdelijk verschuiven naar een lagere waarde^6,7. Daarom wordt het mogelijk om de aggregatieneiging van amyloïde-vormende eiwitten op verschillende leeftijden in levende C. eleganste controleren.

Hier beschrijven we een protocol om de aggregatie te analyseren van een fusie-eiwit bestaande uit verschillende polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44 en Q85). We illustreren hoe de techniek ook kan worden toegepast op verschillende fluorophoren, zoals cyaan fluorescerend eiwit (GVB), geel fluorescerend eiwit (YFP) en monomeric rood fluorescerend eiwit (mRFP); en in alle weefsels van C. elegans,met inbegrip van de neuronen, spieren, en de darm. Bovendien is FLIM in de context van proteostase een zeer nuttig instrument om veranderingen bij uitputting van moleculaire chaperononen waar te nemen. Het neerhalen van een van de belangrijkste moleculaire chaperononen, hitteshock eiwit 1 (hsp-1), via RNA interferentie produceert voortijdige misfolding van eiwitten. De toename van de aggregatiebelasting als gevolg van veroudering, ziekte of gebrekkige chaperonen, wordt vervolgens gemeten als een afname van de levensduur van de fluorescentie.