蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

タンパク質凝集は、老化と病気の両方で起こります。大きいアミロイドまたは非晶質の含物の形成および沈着につながる経路は従いにくく、それらのキネティックは同様に解明に挑戦する。タンパク質は、遺伝性疾患の場合のように、コード配列内の本質的な突然変異のために誤って折り畳まれる可能性があります。タンパク質は、老化の間に起こるように、それらを可溶性に保ち、適切に折り畳まれたプロテオスタシスネットワーク(PN)が損なわれるので、誤って折り畳まれる。PNは、分子シャペロンと分解機械を含み、タンパク質の生物発生、折りたたみ、人身売買、および分解を担当しています^。

C.エレガンスは、その短い寿命、等元性の性質、および遺伝子操作の容易さのために老化と病気を研究するためのモデルとして登場しました。脆弱な組織でヒト疾患を引き起こすタンパク質を発現するいくつかのC.エレガン株トランスジェニック株が作成されました。重要なことに、凝集しやすいタンパク質を含む株の多くは、アミロイド障害の特徴を再現し、大きな含入物の形成を行う。C.エレガンスの透明なボディのおかげで、これらの凝集体は生体内で、非侵襲的かつ非破壊的に²で視覚化することができる。フルオロフォアとの融合で目的のタンパク質(POI)を生成することで、その位置、人身売買、相互作用ネットワーク、および一般的な運命を調査することができます。

我々は、蛍光生涯イメージング顕微鏡(FLIM)を介して、生きているおよび老化したC.エレガンsにおける疾患を引き起こすタンパク質の凝集を監視するプロトコルを提示する。FLIMは、発光スペクトルではなく、蛍光素の寿命に基づく強力な技術です。寿命(τ,τ)は、励起状態から地盤状態に戻るためにフォトンが必要とする平均時間として定義されます。特定の分子の寿命は、時間相関単一光子カウント(TCSPC)の時間領域技術で計算されます。TCSPC-FLIMでは、蛍光減衰機能は、短い高周波レーザーパルスで蛍光関数を励起し、発光子がパルスに関して検出器に到着する時間を測定することによって得られます。サンプルをスキャンする場合、各ピクセルに 3 次元データ配列が作成され、X、Y空間座標におけるフォトンの分布と時間減衰曲線に関する情報が配列に含まれます。したがって、特定のサンプルは、タンパク質の構造、結合、および環境^33、44に関する情報を明らかにする寿命のマップになります。各蛍光タンパク質は、その生理化学的特性に依存する、通常は数ナノ秒(ns)の固有かつ正確に定義された寿命を有する。重要なことに、蛍光体の寿命は、その濃度、蛍光強度、およびイメージング方法論とは無関係である。しかし、生物学的システム内では、pH、温度、イオン濃度、酸素飽和度、および相互作用パートナーなどの環境要因の影響を受ける可能性があります。有効期間は、内部構造の変化や方向にも敏感です。蛍光体をPOIに融合させることで、その寿命が変化し、融合タンパク質の挙動に関する情報が得られます。フルオロフォアがアミロイド構造の抗並列βシートのような密結合環境に包囲または封入されると、非放射的にエネルギーを失い、クエンチ⁵と呼ばれるプロセスである。フルオロフォアの焼入れは、その明らかな寿命の短縮をもたらす。可溶性の場合、タンパク質の寿命は元の、より高い値に近いままになります。対照的に、タンパク質が凝集し始めると、その寿命は必然的に低い値^66、7にシフト^します。したがって、生きているC.エレガンスにおいて異なる年齢で任意のアミロイド形成タンパク質の凝集傾向を監視することが可能になる。

ここでは、異なるポリグルタミン(CAG、Q)ストレッチ(Q40、Q44、およびQ85)を含む融合タンパク質の凝集を分析するプロトコルについて説明します。我々は、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)および単量体赤色蛍光タンパク質(mRFP)などの異なる蛍光性に対してこの技術を均等に適用する方法を示しています。そして、ニューロン、筋肉、および腸を含むC.エレガンスのすべての組織で。さらに、プロテオスタシスの文脈では、FLIMは、分子シャペロンの枯渇時の変化を観察するのに非常に有用なツールです。RNA干渉を介して重要な分子シャペロンの1つであるヒートショックタンパク質1(hsp-1)をノックダウンすると、タンパク質の早期ミスフォールディングが発生します。老化、疾患、またはシャペロン欠損の結果としての凝集負荷の増加は、次いで、蛍光寿命の減少として測定される。