Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Fluorescence Lifetime Imaging

L’aggregazione proteica si verifica sia nell’invecchiamento che nella malattia. I percorsi che portano alla formazione e alla deposizione di grandi amiloidi o inclusioni amorfosi sono difficili da seguire e la loro cinetica è altrettanto difficile da svelare. Le proteine possono misfold a causa di mutazioni intrinseche all’interno delle loro sequenze di codifica, come nel caso delle malattie genetiche. Le proteine si piegano male perché la rete proteostasi (PN) che le mantiene solubili e piegate correttamente è compromessa, come accade durante l’invecchiamento. Il PN comprende chaperones molecolari e macchine per degradazione ed è responsabile della biogenesi, del ripiegamento, del traffico e della degradazione delle proteine¹.

C. elegans è emerso come un modello per studiare l’invecchiamento e la malattia a causa della sua breve durata di vita, della natura isogenica e della facilità di manipolazione genetica. Sono stati creati diversi ceppi transgenici C. elegans che esprimono proteine che causano malattie umane nei tessuti vulnerabili. È importante sottolineare che molti ceppi contenenti proteine soggette ad aggregazione riassumono il segno distintivo dei disturbi amiloidi, la formazione di grandi inclusioni. Grazie al corpo trasparente di C. elegans, questi aggregati possono essere visualizzati in vivo, in modo non invasivo e non distruttivo². Generare qualsiasi proteina di interesse (POI) in fusione con un fluoroforo permette di indagare i suoi luoghi, il traffico, la rete di interazione e il destino generale.

Vi presentiamo un protocollo per monitorare l’aggregazione di proteine che causano malattie nel vivere e nell’invecchiamento C. elegans tramite microscopia imaging a vita di fluorescenza (FLIM). FLIM è una tecnica potente basata sulla durata di un fluoroforo, piuttosto che sui suoi spettri di emissione. La durata (tau, ) è definita come il tempo medio richiesto da un fotone per decadere dal suo stato eccitato al suo stato di terra. La durata di una determinata molecola viene calcolata con la tecnica del dominio temporale del conteggio dei singoli fotoni (TCSPC). In TCSPC-FLIM, la funzione di decadimento fluorescente si ottiene entusiasmando il fluoroforo con impulsi laser brevi e ad alta frequenza e misurando gli orari di arrivo del fotone emesso in un rilevatore rispetto agli impulsi. Durante la scansione di un campione, viene creato un array di dati tridimensionale per ogni pixel: l’array include informazioni sulla distribuzione dei fotoni nelle coordinate spaziali x,y e la loro curva di decadimento temporale. Un dato campione diventa quindi una mappa di vite che rivelano informazioni sulla struttura, il legame e l’ambiente^3,,4. Ogni proteina fluorescente possiede una durata intrinseca e definita con precisione, di solito di pochi nanosecondi (ns), a seconda delle sue proprietà fisiochimiche. È importante sottolineare che la durata di un fluoroforo è indipendente dalla sua concentrazione, dall’intensità fluorescente e dalla metodologia di imaging. Tuttavia, all’interno di un sistema biologico, può essere influenzato da fattori ambientali come pH, temperatura, concentrazioni di ioni, saturazione di ossigeno e suoi partner di interazione. Le durate sono anche sensibili ai cambiamenti strutturali interni e all’orientamento. Fondere un fluoroforo a un POI si traduce in un cambiamento nel suo ciclo di vita e di conseguenza informazioni sul comportamento della proteina fusa. Quando un fluoroforo è circondato o incapsulato in un ambiente strettamente legato, come i fogli beta antiparalleli di una struttura amiloide, perde energia in modo non radiodiativo, un processo noto come spegnimento⁵. Il cinto del fluoroforo comporta un accorciamento della sua vita apparente. Quando è solubile, la vita di una proteina rimarrà più vicina al suo valore originale e più alto. Al contrario, quando una proteina inizia ad aggregarsi, la sua durata si sposterà inevitabilmente su un valore inferiore^6,7. Pertanto, diventa possibile monitorare la propensione di aggregazione di qualsiasi proteina che forma amiloidi in diverse età nel vivere C. elegans.

Qui descriviamo un protocollo per analizzare l’aggregazione di una proteina di fusione che comprende diversi tratti di poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Illustreremo come la tecnica possa essere applicata ugualmente a diversi fluorofori, come la proteina cianescente (CFP), la proteina fluorescente gialla (YFP) e la proteina fluorescente rosso monomerica (mRFP); e in tutti i tessuti di C. elegans, compresi i neuroni, i muscoli e l’intestino. Inoltre, nel contesto della proteostasi, FLIM è uno strumento molto utile per osservare i cambiamenti in seguito all’esaurimento degli chaperoni molecolari. Abbattere uno degli chaperoni molecolari chiave, la proteina da shock termico 1 (hsp-1), tramite l’interferenza dell’RNA produce un ripiegamento errato delle proteine. L’aumento del carico di aggregazione a causa dell’invecchiamento, della malattia o degli accompagnatori carenti carenti, viene quindi misurato come diminuzione della durata della fluorescenza.