Caractérisation des structures amyloïdes dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de l’imagerie à vie de fluorescence

L’agrégation protéique se produit à la fois dans le vieillissement et la maladie. Les voies qui mènent à la formation et au dépôt de grands amyloïdes ou d’inclusions amorphes sont difficiles à suivre et leur cinétique est tout aussi difficile à démêler. Les protéines peuvent se tromper en raison de mutations intrinsèques dans leurs séquences de codage, comme dans le cas des maladies génétiques. Les protéines se déplient également parce que le réseau de protéostasie (PN) qui les maintient solubles et correctement pliés est altéré, comme cela arrive pendant le vieillissement. Le PN comprend les chaperons moléculaires et les machines de dégradation et est responsable de la biogenèse, le pliage, le trafic et la dégradation des protéines¹.

C. elegans est apparu comme un modèle pour étudier le vieillissement et la maladie en raison de sa courte durée de vie, la nature isogénique, et la facilité de manipulation génétique. Plusieurs souches transgéniques C. elegans qui expriment des protéines pathogènes humaines dans les tissus vulnérables ont été créées. Fait important, bon nombre des souches contenant des protéines sujettes à l’agrégation récapitulent la marque des troubles amyloïdes, la formation de grandes inclusions. Grâce au corps transparent de C. elegans, ces agrégats peuvent être visualisés in vivo, non invasivement et nontructivement². Générer n’importe quelle protéine d’intérêt (POI) dans la fusion avec un fluorophore permet d’étudier ses emplacements, le trafic, le réseau d’interaction, et le destin général.

Nous présentons un protocole pour surveiller l’agrégation des protéines pathogènes dans la microscopie imageuse vivante et vieillissante de C. eleganpar l’intermédiaire de la microscopie imageuse à vie de fluorescence (FLIM). FLIM est une technique puissante basée sur la durée de vie d’un fluorophore, plutôt que sur ses spectres d’émission. La durée de vie (tau,) est définie comme le temps moyen requis par un photon pour se décomposer de son état excité de retour à son état au sol. La durée de vie d’une molécule donnée est calculée avec la technique de domaine temporel du comptage du photon unique en corrélation temporelle (TCSPC). Dans TCSPC-FLIM, la fonction de désintégration fluorescente est obtenue en excitant le fluorophore avec des impulsions laser courtes et à haute fréquence et en mesurant les heures d’arrivée du photon émis à un détecteur en ce qui concerne les impulsions. Lors de la numérisation d’un échantillon, un tableau de données tridimensionnel est créé pour chaque pixel : le tableau comprend des informations sur la distribution des photons dans leurs coordonnées spatiales x,y et leur courbe de désintégration temporelle. Un échantillon donné devient donc une carte des vies révélant des informations sur la structure de la protéine, la liaison et l’environnement^3,4. Chaque protéine fluorescente possède une durée de vie intrinsèque et précisément définie, généralement de quelques nanosecondes (ns), dépendante de ses propriétés physiochimiques. Fait important, la durée de vie d’un fluorophore est indépendante de sa concentration, de son intensité fluorescente et de la méthodologie d’imagerie. Cependant, au sein d’un système biologique, il peut être affecté par des facteurs environnementaux tels que le pH, la température, les concentrations d’ions, la saturation en oxygène et ses partenaires d’interaction. Les durées de vie sont également sensibles aux changements structurels internes et à l’orientation. Le fusion d’un fluorophore à un POI entraîne un changement dans sa vie et, par conséquent, des informations sur le comportement de la protéine fusionnée. Lorsqu’un fluorophore est entouré ou encapsulé dans un environnement étroitement lié, comme les feuilles bêta antiparallel d’une structure amyloïde, il perd de l’énergie de façon non radiative, un processus connu sous le nom d’étanchéité⁵. L’étanchéité du fluorophore entraîne un raccourcissement de sa durée de vie apparente. Lorsqu’elle est soluble, la durée de vie d’une protéine restera plus proche de sa valeur d’origine et plus élevée. En revanche, quand une protéine commence à s’agréger, sa durée de vie passera inévitablement à une valeur inférieure^6,7. Par conséquent, il devient possible de surveiller la propension à l’agrégation de toute protéine amyloïde-formant à différents âges dans la vie C. elegans.

Ici, nous décrivons un protocole pour analyser l’agrégation d’une protéine de fusion comprenant différentes étendues de polyglutamine (CAG, Q) (Q40, Q44, et Q85). Nous physions comment la technique peut être appliquée également à différents fluorophores, tels que la protéine fluorescente cyane (PCP), la protéine fluorescente jaune (YFP) et la protéine fluorescente rouge monomérique (mRFP); et dans tous les tissus de C. elegans, y compris les neurones, les muscles et l’intestin. En outre, dans le contexte de la protéostasie, la FLIM est un outil très utile pour observer les changements lors de l’épuisement des chaperons moléculaires. Abattre l’un des principaux chaperons moléculaires, protéine de choc thermique 1 (hsp-1), via l’interférence de l’ARN produit un mauvais pliage prématuré des protéines. L’augmentation de la charge d’agrégation en raison du vieillissement, de la maladie, ou des chaperons déficients, est alors mesurée comme une diminution de la durée de vie de fluorescence.