Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

A agregação proteica ocorre tanto no envelhecimento quanto na doença. Os caminhos que levam à formação e deposição de grandes amilóides ou inclusões amorfas são difíceis de seguir e seus cinéticos são igualmente desafiadores para desvendar. As proteínas podem se desdobrar devido a mutações intrínsecas dentro de suas sequências de codificação, como no caso de doenças genéticas. As proteínas também se desdobram porque a rede de proteota (PN) que as mantém solúveis e devidamente dobradas é prejudicada, como acontece durante o envelhecimento. A PN inclui acompanhantes moleculares e máquinas de degradação e é responsável pela biogênese, dobramento, tráfico e degradação de proteínas¹.

C. elegans emergiu como um modelo para estudar o envelhecimento e a doença devido à sua curta vida útil, natureza isogênica e facilidade de manipulação genética. Várias cepas transgênicas C. elegans que expressam proteínas causadoras de doenças humanas em tecidos vulneráveis foram criadas. É importante ressaltar que muitas das cepas que contêm proteínas propensas à agregação recapitulam a marca registrada de distúrbios amilóides, a formação de grandes inclusões. Graças ao corpo transparente de C. elegans, esses agregados podem ser visualizados in vivo, não invasiva e não destrutivo². Gerar qualquer proteína de interesse (POI) em fusão com um flúor permite investigar suas localizações, tráfico, rede de interação e destino geral.

Apresentamos um protocolo para monitorar a agregação de proteínas causadoras de doenças em vivos e envelhecimento s c. elegans via fluorescência de imagem ao longo da vida (FLIM). FLIM é uma técnica poderosa baseada na vida de um fluoróforo, em vez de seus espectros de emissão. A vida útil (tau, τ) é definida como o tempo médio exigido por um fóton para decair de seu estado animado de volta ao seu estado terrestre. A vida útil de uma determinada molécula é calculada com a técnica de domínio temporal da contagem de fótons únicos correlacionados com o tempo (TCSPC). No TCSPC-FLIM, a função de decaimento fluorescente é obtida por excitar o fluoróforo com pulsos laser curtos e de alta frequência e medir os tempos de chegada do fóton emitido a um detector em relação aos pulsos. Ao digitalizar uma amostra, um conjunto de dados tridimensional é criado para cada pixel: o array inclui informações sobre a distribuição dos fótons em suas coordenadas espaciais x,y e sua curva de decaimento temporal. Uma determinada amostra torna-se, portanto, um mapa de vidas revelando informações sobre a estrutura, a ligação e o ambiente da proteína^3,4. Cada proteína fluorescente possui uma vida útil intrínseca e precisamente definida, geralmente de alguns nanossegundos (ns), dependendo de suas propriedades fisioquímicas. É importante ressaltar que a vida útil de um flofófono é independente de sua concentração, intensidade fluorescente e da metodologia de imagem. No entanto, dentro de um sistema biológico, pode ser afetado por fatores ambientais como pH, temperatura, concentrações de íons, saturação de oxigênio e seus parceiros de interação. As vidas também são sensíveis a mudanças estruturais internas e orientação. Fundir um florofófono a um POI resulta em uma mudança em sua vida útil e, consequentemente, informações sobre o comportamento da proteína fundida. Quando um fluoróforo é cercado ou encapsulado em um ambiente bem ligado, como as folhas beta antiparalelas de uma estrutura amilóide, ele perde energia não radiativamente, um processo conhecido como saciamento⁵. A saciedade do flúor resulta em um encurtamento de sua vida aparente. Quando solúvel, a vida útil de uma proteína permanecerá mais próxima de seu valor original e mais alto. Em contraste, quando uma proteína começa a se agregar, sua vida útil inevitavelmente mudará para um valor mais baixo^6,7. Assim, torna-se possível monitorar a propensão de agregação de qualquer proteína formadora de amilóide em diferentes idades em c. elegansvivos .

Aqui descrevemos um protocolo para analisar a agregação de uma proteína de fusão que compreende diferentes trechos de poliglutamina (CAG, Q) (Q40, Q44 e Q85). Ilustramos como a técnica pode ser aplicada igualmente a diferentes fluoróforos, como proteína fluorescente de ciano (PCP), proteína fluorescente amarela (FpS) e proteína fluorescente vermelha monórica (mRFP); e em todos os tecidos de C. elegans,incluindo os neurônios, músculos e o intestino. Além disso, no contexto da proteotase, a FLIM é uma ferramenta muito útil para observar mudanças no esgotamento das acompanhantes moleculares. Derrubar uma das principais acompanhantes moleculares, a proteína de choque térmico 1 (hsp-1), através da interferência do RNA produz o desdobramento prematuro das proteínas. O aumento da carga de agregação como resultado do envelhecimento, doença ou acompanhantes deficientes, é então medido como uma diminuição na vida útil da fluorescência.