결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성
Summary
임의의 주어진 소분자 리간드에 대해 원하는 친화성 및 특이성을 가진 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템을 만드는 것은 많은 생물학적 감지 및 작동 응용을 가질 것이다. 여기서, 우리는 파지 디스플레이 조합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계적 선택을 통해 화학적으로 유도된 이량화 시스템의 de novo 엔지니어링을 위한 효율적이고 일반화 가능한 방법을 설명한다.
Abstract
작은 분자 리간드의 존재에서만 발생하는 단백질 이분화 이벤트는 생물학적 경로의 해부 및 조작을 위한 소분자 바이오 센서의 개발을 가능하게 합니다. 현재, 제한된 수의 화학적으로 유도된 이량화(CID) 시스템이 존재하며 특정 소분자 리간드에 대한 원하는 감도 및 선택성을 갖춘 새로운 시스템을 엔지니어링하는 것은 단백질 공학 분야에서 여전히 과제로 남아 있습니다. 우리는 여기에 리간드의 큰 다양성에 적용 CID 시스템의 de novo 엔지니어링에 대한 높은 처리량 스크리닝 방법, combinatorial 빈ders-e nabledCID (COMBINES-CID)의 선거를 설명합니다. 이 방법은 파지 디스플레이 조합 nanobody 라이브러리의 2단계 선택을 사용하여 1) 관심 있는 리간드에 먼저 결합하는 “앵커 바인더”를 얻은 다음 2) 앵커 바인더-리간드 복합체에만 결합하는 “이각 바인더”를 얻습니다. 앵커 바인더를 선택하기 위해,109개 이상의 상보성 결정 영역(CDR)-무작위 나노체의 조합 라이브러리가 생체 티니글리드 리간드로 스크리닝되고 적중은 바이오 층 간섭측정(BLI)에 의해 표지되지 않은 리간드로 검증됩니다. 이광 바인더를 얻기 위해, nanobody 라이브러리는 포지티브 스크리닝을 위한 표적으로서 앵커 바인더-리간드 복합체로 스크리닝되고, 음의 스크리닝을 위한 언바운드 앵커 바인더를 갖는다. COMBINES-CID는 다른 면역 글로불린, 비면역글로불린 또는 전산으로 설계된 스캐폴드와 함께 선택한 CID 바인더에 광범위하게 적용되어 약물, 대사 산물, 신호 분자 등의 생체 내 및 생체 내 검출을 위한 바이오 센서를 생성합니다.
Introduction
CID 시스템은 두 단백질이 소분자 리간드의 존재 에서만 이화(그림 1)를분석하고 신진 대사, 신호 화 및 기타 생물학적 경로를 조작하기위한 다양한 도구를 제공합니다1. 이들은 약물 조절 T 세포 활성화2 및 세포사멸3,4,입양 T 세포 치료의 안전성 및 효능을 향상시키기 위한 생물학적 작용의 잠재력을 입증하였다. 추가적으로, 그(것)들은 작은 분자 표적의 생체내 또는 생체외 탐지를 위한 새로운 방법론을 제공합니다. 예를 들어, CID 단백질은 형광 리포터 시스템(예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(FRET)5 및 원형 투과형 형광 단백질6과 유전적으로 융합될 수 있으며, 생체 내 실시간 측정을 위해, 또는 샌드위치 효소 연계 면역소자 분석(ELISA)에 대한 친화성 시약으로서 작용할 수 있다.
광범위한 응용 분야에도 불구하고 주어진 소분자 리간드에 의해 제어될 수 있는 새로운 CID 시스템을 만드는 것은 큰 과제입니다. 동물 면역7,시험관 내 선택8,9및전산 단백질설계(10)를 포함한 확립된 단백질 바인더 엔지니어링 방법은 이진 단백질-리간드 상호작용을 통해 기능하는 리간드 결합 단백질을 생성할 수 있다. 그러나, 이들 방법은 리간드-유도 삼차 CID 복합체를 만드는 데 어려움이 있다. 일부 방법은 동일하거나 상이한단백질11,12,13,14,15, 16에 독립적으로 결합하는 2개의 리간드를 화학적으로 연결함으로써 CID를 생성하거나 기존의 소분자 단백질 복합체를 표적화하는 항체와 같은 바인더 단백질을 선택에 의존하여17,18,따라서 리간드의 제한된 선택을 갖는다.
우리는 최근 CID 시스템19의드 노보 엔지니어링을위한 CID (COMBINES-CID) 방법의 combinatorial 빈ders-e nabled s선거를 개발했다. 이 방법은 리간드-유도 이량화의 높은 특이성을 얻을 수 있다(예를 들어, 앵커-이량화 바인더 해리 상수, K D(리간드 제외)/KD(리간드)> 1,000). 이분 특이성은 리간드 결합 시 형태 변화를 유발할 수 있는 유연한 결합 부위가 있는 앵커 바인더를 사용하여 달성되며, 리간드 결합 앵커 바인더만인식하는 형태선택적 바인더의 선택을 위한 기초를 제공한다. 우리는 나노체의 칸 나비 디올 (CBD)-유도 이종, 보편적 인 스캐폴드와 세 개의 유연한 CDR 루프(그림 2)20을포함하는 카멜리드에서 12-15 kDa 기능성 항체 단편을 생성함으로써 원리 증명을 입증했으며, 이는 소분자 에피토페21,22에대한 적응 가능한 크기의 결합 포켓을 형성할 수 있다. 특히, 결합 단백질 라이브러리의 시험관 내 선택은 동일한 고품질 라이브러리가 상이한 리간드에 적용될 수 있기 때문에 CID 엔지니어링에 대해 비용 효율적이고 일반화되어야 합니다.
이 프로토콜 및 비디오에서, 우리는 앵커의 2단계 체외 선택 및검증(그림 3A)및 이량화 바인더(그림3B)를CBD를 대상으로109보다 높은 다양성을 가진 조합나노라이브러리를 스크리닝함으로써 설명에 초점을 맞추고 있으나, 프로토콜은 다른 단백질 라이브러리 또는 소분자 표적에 적용되어야 한다. CID 바인더의 스크리닝은 일반적으로 6-10 주가 걸립니다(그림 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 바이오패닝 라운드에 대해 입력 파지 라이브러리의 정확한 농도를 선택하는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 ~1012-1013 파지 입자의 입력 라이브러리에서 시작 다양성 >109,각 파지 클론의 ~ 100-1,000 사본을 풀 다운 분석에 제시 할 수 있도록. 결합 분석에서 파지 농도가 너무 높거나 낮으면 비특이적 결합 또는 양성 클론의 손실 가능성이 증가합니다. 앵커 또는 이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 워싱턴 대학 혁신 상 (L.G.), 미국 국립 보건원 (1R35GM128918에서 L.G.에) 및 워싱턴 대학의 스타트업 기금 (L.G.)의 보조금에 의해 지원되었습니다. H.J.는 워싱턴 연구 재단 학부 펠로우십의 지원을 받았습니다. K.W.는 워싱턴 대학 단백질 디자인 연구소의 학부 펠로우십을 지원받았습니다.
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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