Summary

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek

Published: January 14, 2020
doi:

Summary

Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.

Abstract

Eiwit door dimerisatie gebeurtenissen die alleen optreden in de aanwezigheid van een kleine molecule ligand maken de ontwikkeling van kleine-molecuul biosensoren voor de dissectie en manipulatie van biologische trajecten. Momenteel bestaat er slechts een beperkt aantal chemisch geïnduceerde door dimerisatie (CID)-systemen en worden nieuwe technieken met de gewenste gevoeligheid en selectiviteit voor specifieke kleine molecuul liganden een uitdaging op het gebied van proteïne-engineering. Hier beschrijven we een hoge doorvoer screeningsmethode, combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van Cid (combineert-CID), voor de de Novo engineering van CID systemen toepasbaar op een grote verscheidenheid van liganden. Deze methode maakt gebruik van de tweestapsselectie van een Phage-weergegeven combinatoriale nanobody-bibliotheek om 1) “anker Binders” te verkrijgen die eerst binden aan een ligand van belang en vervolgens 2) “dimerization bindmiddelen” die alleen binden aan anker Binder-ligand complexen. Om anker binders te selecteren, wordt een combinatorische bibliotheek van meer dan 109 -gerandomiseerde nanolichamen gescreend met een biotinyleerd ligand en worden hits gevalideerd met de niet-gelabelde ligand door bio-Layer interferometrie (bli). Om bindmiddelen te verkrijgen, wordt de nanobody-bibliotheek gescreend met anker Binder-ligand-complexen als doelen voor positieve screening en de niet-afhankelijke anker Binders voor negatieve screening. COMBINEERT-CID is algemeen toepasbaar om CID binders te selecteren met andere immunoglobulin, niet-immunoglobulin, of computationeel ontworpen steigers om biosensoren te creëren voor in vitro en in vivo detectie van geneesmiddelen, metabolieten, signaal moleculen, enz.

Introduction

CID-systemen, waarin twee eiwitten alleen in de aanwezigheid van een klein-molecuul ligand (Figuur 1) dimeriseren, bieden veelzijdige gereedschappen voor het ontleden en manipuleren van metabole, signalering en andere biologische trajecten1. Ze hebben aangetoond dat het potentieel in biologische werking, zoals drug gecontroleerde t-cel activering2 en apoptosis3,4, voor het verbeteren van de veiligheid en werkzaamheid van adoptie t-cel therapie. Daarnaast bieden ze een nieuwe methodologie voor in vivo of in vitro detectie van kleine molecuul doelen. Zo kunnen Cid-eiwitten genetisch worden gefuseerd met fluorescentie reporter systemen (bijv. fluorescentie resonantie energie overdracht (fret)5 en circulair pergedempt fluorescerende eiwitten)6 voor real-time in vivo metingen, of dienen als affiniteits reagentia voor sandwich-enzym-linked immunosorbent assay (Elisa)-achtige assays.

Ondanks hun brede toepassingen, het creëren van nieuwe CID systemen die kunnen worden bestuurd door een bepaalde kleine-molecuul ligand heeft grote uitdagingen. Gevestigde eiwit Binder engineering methoden, waaronder de dierlijke immunisatie7, in vitro selectie8,9, en computationele eiwit ontwerp10 kunnen ligand bindende eiwitten die functioneren via binaire eiwit-ligand interacties te genereren. Echter, deze methoden hebben problemen met het creëren van een ligand-geïnduceerde ternaire Cid complex. Sommige methoden maken de Cid door het chemisch koppelen van twee liganden die onafhankelijk binden aan dezelfde of verschillende eiwitten11,12,13,14,15,16 of afhankelijk zijn van het selecteren van bindmiddel eiwitten zoals antilichamen gericht op bestaande kleine molecuul-eiwitcomplexen17,18, en hebben dus een beperkte keuze aan liganden.

Onlangs ontwikkelden we een combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van de Cid (combineert-CID) methode voor de Novo engineering van CID Systems19. Deze methode kan de hoge specificiteit van ligand-geïnduceerde door dimerisatie verkrijgen (bijv. een anker-door dimerisatie Binder dissociatieconstante, kd (zonder ligand)/kd (met ligand) > 1.000). De door dimerisatie specificiteit wordt bereikt met behulp van anker Binders met flexibele bindingsplaatsen die conformationele veranderingen kunnen introduceren op ligand binding, die een basis bieden voor de selectie van conformationaal selectieve bindmiddelen die alleen ligand-gebonden anker binders herkennen. We toonden een proof-of-principe door het creëren van Cannabidiol (CBD)-geïnduceerde heterodimers van nanolichamen, een 12 – 15 kDa functionele antilichaam fragment van camelid bestaande uit een universele steiger en drie flexibele CDR loops (Figuur 2)20, die een bindende zak kan vormen met aanpasbare maten voor kleine-molecuul epitopen21,22. Met name de in vitro selectie van een combinatorische proteïne-bibliotheek moet kostenbesparend en generaliseerbaar zijn voor CID engineering omdat dezelfde hoogwaardige bibliotheek kan worden toegepast op verschillende liganden.

In dit protocol en deze video richten we ons op het beschrijven van de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker (Figuur 3A) en door dimerisatie bindmiddelen (Figuur 3B) door de combinatoriale nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 109 met CBD als doel, maar het protocol moet toepasbaar zijn op andere eiwit bibliotheken of kleine molecuul doelen. De screening van CID binders duurt meestal 6 – 10 weken (Figuur 4).

Protocol

1. bibliotheek constructie Gebruik een synthetische combinatorische bibliotheek met één domein antilichamen met een diversiteit van ~ 1,23 – 7.14 x 109, zoals eerder beschreven19. Hoewel dit protocol geen bibliotheek constructie bevat, kan het worden toegepast op andere combinatorische Binder bibliotheken. 2. biotinylatie van ligand target of ligand Biotinylaat de geselecteerde ligand, bijvoorbeeld, CBD en tetrahydrocannabinol (T…

Representative Results

We beschrijven de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker-en door dimerisatie bindmiddelen door de combinatorische nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 109 met CBD als doel. Beoordeling van de verrijking van de faag biopanning tijdens de opeenvolgende selectie rondes voor zowel anker-als door dimerisatie bindmiddelen is belangrijk. Typische verrijking resultaten na 4 – 6 selectie rondes zoals weergegeven in afbeelding 5 zijn een goede indicatie d…

Discussion

Het is essentieel om te kiezen van de juiste concentraties van de invoer faag bibliotheken voor verschillende rondes van biopanning. We zijn meestal gestart vanuit een invoer bibliotheek van ~ 1012– 1013 faag deeltjes met een diversiteit > 109, waardoor ~ 100 – 1000 kopieën van elke faag-kloon worden weergegeven in de pull-down assay. Als de faag concentratie in een bindende assay te hoog of te laag is, zal de waarschijnlijkheid van niet-specifieke binding of verlies van positieve kl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de University of Washington Innovation Award (to L.G.), een subsidie van de Amerikaanse National Institutes of Health (1R35GM128918 tot L.G.), en een startup Fonds van de Universiteit van Washington (naar L.G.). H.J. werd gesteund door de Washington Research Foundation undergraduate Fellowship. K.W. werd gesteund door een undergraduate Fellowship van het University of Washington Institute for protein design.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

View Video