Het creëren van chemisch geïnduceerde eiwit door dimerisatie systemen met de gewenste affiniteit en specificiteit voor een bepaalde kleine molecule ligand zou veel biologische sensing en bediening toepassingen. Hier beschrijven we een efficiënte, generaliseerbare methode voor de Novo engineering van chemisch geïnduceerde door dimerisatie systemen via de stapsgewijze selectie van een Phage-weergegeven combinatorische single-Domain antilichamen bibliotheek.
Eiwit door dimerisatie gebeurtenissen die alleen optreden in de aanwezigheid van een kleine molecule ligand maken de ontwikkeling van kleine-molecuul biosensoren voor de dissectie en manipulatie van biologische trajecten. Momenteel bestaat er slechts een beperkt aantal chemisch geïnduceerde door dimerisatie (CID)-systemen en worden nieuwe technieken met de gewenste gevoeligheid en selectiviteit voor specifieke kleine molecuul liganden een uitdaging op het gebied van proteïne-engineering. Hier beschrijven we een hoge doorvoer screeningsmethode, combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van Cid (combineert-CID), voor de de Novo engineering van CID systemen toepasbaar op een grote verscheidenheid van liganden. Deze methode maakt gebruik van de tweestapsselectie van een Phage-weergegeven combinatoriale nanobody-bibliotheek om 1) “anker Binders” te verkrijgen die eerst binden aan een ligand van belang en vervolgens 2) “dimerization bindmiddelen” die alleen binden aan anker Binder-ligand complexen. Om anker binders te selecteren, wordt een combinatorische bibliotheek van meer dan 109 -gerandomiseerde nanolichamen gescreend met een biotinyleerd ligand en worden hits gevalideerd met de niet-gelabelde ligand door bio-Layer interferometrie (bli). Om bindmiddelen te verkrijgen, wordt de nanobody-bibliotheek gescreend met anker Binder-ligand-complexen als doelen voor positieve screening en de niet-afhankelijke anker Binders voor negatieve screening. COMBINEERT-CID is algemeen toepasbaar om CID binders te selecteren met andere immunoglobulin, niet-immunoglobulin, of computationeel ontworpen steigers om biosensoren te creëren voor in vitro en in vivo detectie van geneesmiddelen, metabolieten, signaal moleculen, enz.
CID-systemen, waarin twee eiwitten alleen in de aanwezigheid van een klein-molecuul ligand (Figuur 1) dimeriseren, bieden veelzijdige gereedschappen voor het ontleden en manipuleren van metabole, signalering en andere biologische trajecten1. Ze hebben aangetoond dat het potentieel in biologische werking, zoals drug gecontroleerde t-cel activering2 en apoptosis3,4, voor het verbeteren van de veiligheid en werkzaamheid van adoptie t-cel therapie. Daarnaast bieden ze een nieuwe methodologie voor in vivo of in vitro detectie van kleine molecuul doelen. Zo kunnen Cid-eiwitten genetisch worden gefuseerd met fluorescentie reporter systemen (bijv. fluorescentie resonantie energie overdracht (fret)5 en circulair pergedempt fluorescerende eiwitten)6 voor real-time in vivo metingen, of dienen als affiniteits reagentia voor sandwich-enzym-linked immunosorbent assay (Elisa)-achtige assays.
Ondanks hun brede toepassingen, het creëren van nieuwe CID systemen die kunnen worden bestuurd door een bepaalde kleine-molecuul ligand heeft grote uitdagingen. Gevestigde eiwit Binder engineering methoden, waaronder de dierlijke immunisatie7, in vitro selectie8,9, en computationele eiwit ontwerp10 kunnen ligand bindende eiwitten die functioneren via binaire eiwit-ligand interacties te genereren. Echter, deze methoden hebben problemen met het creëren van een ligand-geïnduceerde ternaire Cid complex. Sommige methoden maken de Cid door het chemisch koppelen van twee liganden die onafhankelijk binden aan dezelfde of verschillende eiwitten11,12,13,14,15,16 of afhankelijk zijn van het selecteren van bindmiddel eiwitten zoals antilichamen gericht op bestaande kleine molecuul-eiwitcomplexen17,18, en hebben dus een beperkte keuze aan liganden.
Onlangs ontwikkelden we een combinatorial binders-eingeschakeld sverkiezing van de Cid (combineert-CID) methode voor de Novo engineering van CID Systems19. Deze methode kan de hoge specificiteit van ligand-geïnduceerde door dimerisatie verkrijgen (bijv. een anker-door dimerisatie Binder dissociatieconstante, kd (zonder ligand)/kd (met ligand) > 1.000). De door dimerisatie specificiteit wordt bereikt met behulp van anker Binders met flexibele bindingsplaatsen die conformationele veranderingen kunnen introduceren op ligand binding, die een basis bieden voor de selectie van conformationaal selectieve bindmiddelen die alleen ligand-gebonden anker binders herkennen. We toonden een proof-of-principe door het creëren van Cannabidiol (CBD)-geïnduceerde heterodimers van nanolichamen, een 12 – 15 kDa functionele antilichaam fragment van camelid bestaande uit een universele steiger en drie flexibele CDR loops (Figuur 2)20, die een bindende zak kan vormen met aanpasbare maten voor kleine-molecuul epitopen21,22. Met name de in vitro selectie van een combinatorische proteïne-bibliotheek moet kostenbesparend en generaliseerbaar zijn voor CID engineering omdat dezelfde hoogwaardige bibliotheek kan worden toegepast op verschillende liganden.
In dit protocol en deze video richten we ons op het beschrijven van de twee-stap in vitro selectie en validatie van anker (Figuur 3A) en door dimerisatie bindmiddelen (Figuur 3B) door de combinatoriale nanobody Library te screenen met een diversiteit hoger dan 109 met CBD als doel, maar het protocol moet toepasbaar zijn op andere eiwit bibliotheken of kleine molecuul doelen. De screening van CID binders duurt meestal 6 – 10 weken (Figuur 4).
Het is essentieel om te kiezen van de juiste concentraties van de invoer faag bibliotheken voor verschillende rondes van biopanning. We zijn meestal gestart vanuit een invoer bibliotheek van ~ 1012– 1013 faag deeltjes met een diversiteit > 109, waardoor ~ 100 – 1000 kopieën van elke faag-kloon worden weergegeven in de pull-down assay. Als de faag concentratie in een bindende assay te hoog of te laag is, zal de waarschijnlijkheid van niet-specifieke binding of verlies van positieve kl…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de University of Washington Innovation Award (to L.G.), een subsidie van de Amerikaanse National Institutes of Health (1R35GM128918 tot L.G.), en een startup Fonds van de Universiteit van Washington (naar L.G.). H.J. werd gesteund door de Washington Research Foundation undergraduate Fellowship. K.W. werd gesteund door een undergraduate Fellowship van het University of Washington Institute for protein design.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |