Создание химически индуцированных систем димеризации белка с желаемой близостью и специфичностью для любой небольшой молекулы лиганд будет иметь много биологических приложений зондирования и активации. Здесь мы описываем эффективный, обобщенный метод де Ново-инженерии химически индуцированных систем димеризации через пошаговый выбор фаговычной библиотеки антител, отображаемой фагой.
События димеризации белка, происходящие только в присутствии маломолекулярного лигана, позволяют развивать маломолекулярные биосенсоры для вскрытия и манипуляции биологическими путями. В настоящее время существует лишь ограниченное число химически индуцированных систем димеризации (CID), и проектирование новых с желаемой чувствительностью и избирательностью для конкретных малых молекуловых лигандов остается проблемой в области белковой инженерии. Мы здесь описываем метод скрининга высокой пропускной записи, комбинаториальный биндерс-e nabled sизбрание CID (COMBINES-CID), для de novo инженерных систем CID, применимых к большому разнообразию лигандов. Этот метод использует двухступенчатый выбор фаговычных комбинаторных нано-библиотеки для получения 1) “якорных связующих”, которые сначала связываются с лигандой интереса, а затем 2) “димеризации связующих”, которые связывают только якорь связующего-лигандкомплексов. Для выбора якорных связующих, комбинаторная библиотека более 109 комплементарно-определяющих области (CDR)-рандомизированные нанотела проверяются с помощью биотиниляции лиганда и хиты проверяются с немаркированной лигандостью биослойной интерферометрией (BLI). Для получения димеризации связующих, наникто библиотека проверяется с якорным связующего-лиганд комплексов в качестве мишеней для положительного скрининга и несвязанных связующих якорных связующих для отрицательного скрининга. COMBINES-CID широко применима к выбору связующих CID с другими иммуноглобулином, неиммуноглобулином или вычислительно разработанными эшафотами для создания биосенсоров для in vitro и in vivo обнаружения лекарств, метаболитов, сигнальных молекул и т.д.
СИСТЕМы CID, в которых два белка димеризируются только в присутствии маломолекулярного лиганда(рисунок 1), предлагают универсальные инструменты для вскрытия и манипулирования метаболическими, сигнальными и другими биологическими путями1. Они продемонстрировали потенциал в биологической активации, таких как контролируемые препаратами Т-клеточной активации2 и апоптоз3,4, для повышения безопасности и эффективности приемной Т-клеточной терапии. Кроме того, они обеспечивают новую методологию для in vivo или in vitro обнаружения малых молекул. Например, белки CID могут быть генетически слиты с системами репортера флуоресценции (например, флуоресцентный резонанс передачи энергии (FRET)5 и круговой перемутированный флуоресцентные белки)6 для измерения в режиме реального времени в виво, или служить в качестве сродства реагентов для сэндвич фермент-связанных иммуносорбентовых анализов (ELISA) – как анализы.
Несмотря на их широкое применение, создание новых систем CID, которые могут управляться данной маломолекулярной лигандой, имеет серьезные проблемы. Установленные методы инженерного связующего белка, включая иммунизацию животных7,выбор в пробирке8,9,и вычислительный дизайн белка10 может генерировать лиганд связывающие белки, которые функционируют через бинарные взаимодействия белка-лигада. Тем не менее, эти методы имеют трудности создания лиганд-индуцированной ternary CID комплекса. Некоторые методы создают CID путем химически соединяя 2 ligands которые независимо связывают к таким же или по-разному протеитам11,12,13,14,15,16или полагаются на выбирать протеины связующего, such as антитела пристрелящие preexisting малые комплексы молекул-протеина17,18, и таким образом имеют лимитированный выбор ligands.
Недавно мы разработали комбинаториальный биндерс-e nabled сизбранием CID (COMBINES-CID) метод для де Ново инженерных систем CID19. Этот метод может получить высокую специфичность лиганд-индуцированной димеризации (например, якорь-димеризации связующего диссоциации постоянной, KD (без лиганда)/KD (с лигандой) Специфика димеризации достигается с помощью якорных связующих с гибкими связывающими участками, которые могут вводить конформационные изменения при связывании лиганда, обеспечивая основу для выбора конформистски селективных связующих только распознавающих связующие якорные связующие, связанные с лигандой. Мы продемонстрировали доказательство принципа, создавая каннабидиол (CBD) индуцированных гетеродидеров нанотел, 12-15 kDa функциональный фрагмент антитела из верескации, состоящий из универсальной эшафот и три гибких CDR петли (Рисунок 2)20, который может сформировать связывающий карман с адаптируемыми размерами для малых молекул эпитопов21. Примечательно, что выбор в пробирке библиотеки комбинаторного белка должен быть экономически эффективным и обобщенным для инженерии CID, поскольку один и тот же высококачественный библиотечный может быть применен к различным лиганам.
В этом протоколе и видео, мы сосредоточены на описании двухступенчатой в пробирке выбор и проверка якоря(Рисунок 3A) и димеризации связующих(Рисунок 3B) путем скрининга комбинаторных наивных библиотек с разнообразием выше 109 использованием КБР в качестве мишени, но протокол должен быть применим к другим библиотекам белка или малых молекул цели. Скрининг CID связующих обычно занимает 6-10 недель(рисунок 4).
Очень важно выбрать правильные концентрации входных фаговых библиотек для различных раундов биопанирования. Как правило, мы начинали с входной библиотеки в 1012-1013 фаговых частиц с разнообразием no109, что позволяет 100-1000 копий каждого фагового клона, которые будут предст…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Университетом Вашингтона Инновационная премия (Л.Г.), грант от Национальных институтов здравоохранения США (1R35GM128918 в L.G.), и стартап-фонд Университета Вашингтона (в L.G.). H.J. была поддержана стипендией Вашингтонского исследовательского фонда. KW была поддержана стипендией бакалавриата из Вашингтонского университета Института белкового дизайна.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |