Création de systèmes de dimerisation des protéines hautement spécifiques induits par des produits chimiques par stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Un-Domain Un-Domain Un-Domain Body Library

Les systèmes CID, dans lesquels deux protéines se dimerisent seulement en présence d’un ligand à petites molécules (figure 1), offrent des outils polyvalents pour disséquer et manipuler les voies métaboliques, de signalisation et autres voies biologiques¹. Ils ont démontré le potentiel dans l’actionnement biologique, tel que l’activation de cellule T drogue-commandée² et l’apoptose^3,4, pour améliorer l’innocuité et l’efficacité de la thérapie de cellule T adoptive. En outre, ils fournissent une nouvelle méthodologie pour la détection in vivo ou in vitro des cibles de petites molécules. Par exemple, les protéines CID peuvent être génétiquement fusionnées avec des systèmes de rapporteur de fluorescence (p. ex., transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET)⁵ et protéines fluorescentes permutées circulairement)⁶ pour des mesures in vivo en temps réel, ou servir de réactifs d’affinité pour les analyses immunosorbent liées à l’enzyme sandwich (ELISA).

Malgré leurs applications étendues, la création de nouveaux systèmes CID qui peuvent être contrôlés par un ligand à petites molécules donnée présente des défis majeurs. Les méthodes établies d’ingénierie de liant de protéine comprenant la vaccination^{animale 7,}la sélection in vitro^8,9, et la conception de protéine computationnelle¹⁰ peuvent produire des protéines de liaison de ligand qui fonctionnent par l’intermédiaire des interactions binaires de protéine-ligand. Cependant, ces méthodes ont des difficultés à créer un complexe de CID ternaire induit par ligand. Certaines méthodes créent CID en reliant chimiquement deux ligands qui se lient indépendamment aux mêmes protéines ou différentes^{11,12,13,14,15,16} ou s’appuient sur la sélection de protéines de liant tels que les anticorps ciblant préexistant sa petite molécule-protéines complexes^17,18, et ont donc un choix limité de ligands.

Nous avons récemment développé une combinatorial binders-enabled sélection de CID (COMBINES-CID) méthode pour l’ingénierie de novo des systèmes CID¹⁹. Cette méthode peut obtenir la grande spécificité de la dimerisation induite par ligand (par exemple, une dissociation de liant d’ancrage-dimerisation constante, K_D (sans ligand)/K_D (avec ligand) -gt; 1.000). La spécificité de la dimerisation est obtenue à l’aide de liants d’ancrage avec des sites de liaison flexibles qui peuvent introduire des changements conformationnels lors de la liaison ligand, fournissant une base pour la sélection de liants sélectifs conformationnellement ne reconnaissant que les liants d’ancrage ligand-liés. Nous avons démontré une preuve de principe en créant des hétérodimères induits par le cannabidiol (CBD) de nanocorps, un fragment d’anticorps fonctionnel de 12 à 15 kDa à partir de camélidés comprenant un échafaudage universel et trois boucles CDR flexibles (Figure 2)²⁰, qui peuvent former une poche de liaison avec des tailles adaptables pour les épitopes de petites molécules^21,22. Notamment, la sélection in vitro d’une bibliothèque de protéines combinatoires devrait être rentable et généralisable pour l’ingénierie CID parce que la même bibliothèque de haute qualité peut être appliquée à différents ligands.

Dans ce protocole et cette vidéo, nous nous concentrons sur la description de la sélection in vitro en deux étapes et de la validation des liants d’ancrage (figure 3A) et des liants de dimerisation (figure 3B) en examinant la bibliothèque combinatoire nanobody avec une diversité supérieure à 10⁹ en utilisant le CBD comme cible, mais le protocole devrait s’appliquer à d’autres bibliothèques de protéines ou à des cibles à petites molécules. Le dépistage des liants CID prend habituellement de 6 à 10 semaines(figure 4).