יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.
אירועים מדימריזציה של חלבונים המתרחשים רק בנוכחות של מולקולה קטנה ומאפשרים פיתוח של מולקולה קטנה ביולוגית לניתוח ומניפולציה של מסלולים ביולוגיים. כיום, רק מספר מוגבל של מערכות dimerization בהשפעת כימית (CID) קיימים והנדסה חדשים עם רגישות הרצויה וסלקטיביות עבור ליגניות מולקולות קטנות מסוימות נשאר אתגר בתחום הנדסת חלבונים. אנו מתארים את השיטה הקרנת תפוקה גבוהה, comביננדרס בן ders-e nabled הבחירות שלסיד (משלב סיד), עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות החלים על מגוון רחב של ליגנדס. שיטה זו משתמשת בבחירה בשני השלבים של הספרייה phage מוצג קומבינטורית ננוגוף כדי לקבל 1) “עוגן אוגדן” כי לאגד הראשון כדי להשיג ולאחר מכן 2) “dimerization קלסרים” כי רק לאגד עוגן מאגד-ליגנד מכלולי. כדי לבחור בקלסרים עוגן, ספריית קומבינטורית של מעל 109 האזור משלימה לקביעת (cdr)-ננוגופים אקראיים מוקרן עם ligtinylated וכניסות מאומתים עם ליגנד על ידי ביולוגי אינטרפרומטריה (בלי). כדי להשיג בקלסרים dimerization הספרייה הננו מוקרן עם העוגן קלסר-ligand מכלולי כמטרות עבור הקרנה חיובית ואוגדן עוגן מאוגד עבור הקרנה שלילית. משלבת-CID ישימה באופן כללי כדי לבחור בקלסרים CID עם חיסוני אחרים, non-חיסוני, או בחינה חישובית עוצב מתוכננת הפיגומים כדי ליצור ביוחיישנים עבור מבחנה ב-vivo זיהוי של תרופות, מטבוליטים, מולקולות איתות, וכו ‘.
CID מערכות, שבו שני חלבונים dimerize רק בנוכחות של מולקולה קטנה (איור 1), מציעים כלים רב-תכליתי לניתוח ותפעול מטבולית, איתות, ומסלולים ביולוגיים אחרים1. הם הפגינו את הפוטנציאל בהפעלה ביולוגית, כגון הפעלה מבוקרת סמים T2 ו אפופטוזיס3,4, לשיפור הבטיחות והיעילות של טיפול תא T המאמצת. בנוסף, הם מספקים מתודולוגיה חדשה בvivo או בזיהוי מתורבת של מטרות מולקולות קטנות. לדוגמה, חלבונים CID יכול להיות התמזגו גנטית עם מערכות העיתונאי הניאון (g., העברת אנרגיה בתהודה של אור השמש (למשל)5 ו מעגליות חלבונים פלורסנט מושתק)6 עבור בזמן אמת במדידות vivo, או לשמש ריאגנטים אהדה עבור כריך האנזים מקושר חיסוני כפוף (אליסה)-כמו assays.
למרות היישומים הרחבים שלהם, יצירת מערכות CID חדשות שיכולות להיות נשלטות על-ידי מולקולה קטנה ובעלת אתגרים מרכזיים. הוקמה שיטות הנדסה חלבון קלסר כולל חיסון בעלי חיים7, בחירה מחוץ גופית8,9, ועיצוב חלבון חישובית10 יכול ליצור ליגנד מחייב חלבונים הפועלים באמצעות חלבון בינארי-ליגנד אינטראקציות. עם זאת, שיטות אלה יש קשיים ביצירת מתחם CID ליגארי המושרה. כמה שיטות ליצור סיד על ידי קישור כימי שני ליגניות כי באופן עצמאי לאגד את אותם חלבונים או שונים11,12,13,14,15,16 או להסתמך על בחירת חלבונים קלסר כגון נוגדנים ליעד מולקולה קטנה מולקולת חלבון מתחמים17,18, ולכן יש מבחר מוגבל של ליגנדס.
פיתחנו לאחרונה מקוםהבחירה של החבר ‘ ה–e NABLEDהבחירות של סיד (משלבת סיד) שיטה עבור דה נובו הנדסה של סיד מערכות19. שיטה זו יכולה להשיג את היחודיות הגבוהה של דימרזציה (לדוגמה, קבוע עוגן-דימרזציה, kd (ללא Ligand)/kd (עם ligand) > 1,000). ספציפיות הדימרזציה מושגת באמצעות קלסרים עוגן עם אתרי קשירה גמישים שיכולים להציג שינויים מתרניים עם ליגנד מחייב, מתן בסיס לבחירה של קלסרים סלקטיבי מבחינה מבצעית רק לזהות ליגור העוגן אוגדן. הדגמנו הוכחה של עקרון על ידי יצירת קנאידיל (CBD) המושרה הטרודימרס של nanobodies, 12 – 15 מקטע נוגדן מסוג kda מתוך גמליים הכוללת פיגום אוניברסלי ושלושה cdr לולאות גמיש (איור 2)20, אשר יכול ליצור כיס מחייב עם הגדלים של מולקולהקטנה מולקולות21. בעיקר, הבחירה מחוץ גופית של ספריית החלבון קומבינטורית צריך להיות חסכוני וכללי עבור הנדסת CID, כי הספרייה באיכות גבוהה ניתן להחיל על ליגניות שונות.
בפרוטוקול זה וידאו, אנו מתמקדים בתיאור שני שלבים בחירת מבחנה ואימות של עוגן (איור 3A) ו dimerization קלסרים (איור 3ב) על ידי הקרנת ספריית קומבינטורית nanobody עם גיוון גבוה יותר 109 באמצעות CBD כיעד, אבל הפרוטוקול צריך להיות ישים לספריות חלבון אחרות או מולקולות קטנות מטרות. ההקרנה של בקלסרים CID לוקח בדרך כלל 6 – 10 שבועות (איור 4).
חשוב לבחור את הריכוזים הנכונים של ספריות phage קלט עבור סיבובים שונים של ביואננינג. אנחנו בדרך כלל התחלנו מספריית הקלט של ~ 1012– 1013 phage חלקיקים עם גיוון > 109, המאפשר ~ 100-1000 עותקים של כל שיבוט phage להיות מוצג בתוך שיטת המשיכה למטה. אם הריכוז phage בתוך הסדר מחייב הוא גבוה מדי או נמוך, ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי פרס החדשנות אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.), מענק של U.S. המכונים הלאומיים לבריאות (1R35GM128918 כדי L.G.), ו קרן אתחול של אוניברסיטת וושינגטון (כדי L.G.). H.J. היתה נתמכת על ידי מלגת קרן וושינגטון למחקר. K.W. נתמכת על ידי מלגת לתואר ראשון מהמכון לעיצוב חלבונים באוניברסיטת וושינגטון.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |