Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.
Sadece küçük moleküllü bir ligand varlığında meydana gelen protein dimerizasyon olayları, biyolojik yolların diseksiyonu ve manipülasyonu için küçük moleküllü biyosensörlerin geliştirilmesini sağlar. Şu anda, kimyasal olarak indüklenen dimerization (CID) sistemlerinin sadece sınırlı sayıda var ve belirli küçük moleküllü ligandlar için istenilen duyarlılık ve seçicilik ile mühendislik yenileri protein mühendisliği alanında bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada yüksek bir iş-iş tarama yöntemi, combinatorial binders-enabled sseçim CID (COMBINES-CID), cid sistemlerinin de novo mühendislik ligands büyük bir çeşitlilik için geçerli dir. Bu yöntem, ilk ilgi bir ligand ve daha sonra 2) “dimerization bağlayıcılar” sadece bağlantı bağlayıcı-ligand kompleksleri bağlamak bağlamak 1) “çapa bağlayıcıları” elde etmek için bir faj görüntülenen kombinatoryal nanobody kütüphane iki adımlı seçim kullanır. Çapa bağlayıcılarını seçmek için,10’dan fazla 9 tamamlayıcılık belirleyici bölgeden (CDR) randomize nanocisi olan bir kombinatoryal kütüphane biyotinylated ligand ile taranır ve isabetler biyo-katman interferometrisi (BLI) ile etiketlenmemiş ligand ile doğrulanır. Dimerization bağlayıcıları elde etmek için, nanobody kitaplığı pozitif tarama için hedef olarak çapa bağlayıcı-ligand kompleksleri ve negatif tarama için bağlanmamış çapa bağlayıcıları ile taranır. BİrLEŞTİrME-CID, diğer immünglobulin, immünoglobulin olmayan veya ilaç, metabolitler, sinyal molekülleri vb in vitro ve in vivo algılama için biyosensörler oluşturmak için hesaplamalı olarak tasarlanmış iskeleler ile cid bağlayıcıları seçmek için geniş uygulanabilir.
Cid sistemleri, hangi iki protein sadece küçük moleküllü ligand varlığında dimerize (Şekil 1), diseksiyon ve metabolik manipüle için çok yönlü araçlar sunuyoruz, sinyal, ve diğer biyolojik yollar1. Onlar biyolojik aktüasyon potansiyelini göstermiştir, ilaç kontrollü T hücre aktivasyonu gibi2 ve apoptosis3,4,benimseyen T hücre tedavisinin güvenliği ve etkinliğini artırmak için. Ayrıca, küçük moleküllü hedeflerin in vivo veya in vitro tespiti için yeni bir metodoloji sağlarlar. Örneğin, CID proteinleri genetik olarak floresan muhabir sistemleri (örneğin, floresan rezonans enerji transferi (FRET)5 ve dairesel olarak permuted floresan proteinler)6 ile gerçek zamanlı in vivo ölçümler için eritilebilir veya sandviç enzimbağlantılı immünosorbent tahlil (ELISA) benzeri tahliller için yakınlık reaktifleri olarak hizmet verebilir.
Geniş uygulamalarına rağmen, belirli bir küçük moleküllü ligand tarafından kontrol edilebilen yeni CID sistemlerinin oluşturulması büyük zorluklara sahiptir. Hayvan bağışıklama dahil olmak üzere kurulan protein bağlayıcı mühendislik yöntemleri7, in vitro selection8,9, ve hesaplamalı protein tasarımı10 ikili protein-ligand etkileşimleri ile işlev ligand bağlayıcı proteinler üretebilir. Ancak, bu yöntemler ligand kaynaklı üçüncü CID kompleksi oluşturmakta güçlük sahiptir. Bazı yöntemler kimyasal olarak aynı veya farklıproteinler11, 12,13,14,15,16 bağlamak veya önceden varolan küçük molekül-protein kompleksleri 17 hedefleyen antikorlar gibi bağlayıcı proteinleri seçerek güveniki ligandlar bağlayarak CID oluşturmak17,18, ve böylece ligands sınırlı bir seçim var.
Cid sistemlerinin de novo mühendisliği için cid (COMBINES-CID) yönteminin combinatorial binders-enabled sseçim geliştirdik19. Bu yöntem, ligand kaynaklı dimerizasyon yüksek özgüllük elde edebilirsiniz (örneğin, bir çapa-dimerization bağlayıcı dissosilasyon sabiti, KD (ligand olmadan)KD (ligand ile) > 1.000). Dimerizasyon özgüllüğü, ligand bağlama üzerine konformasyonel değişiklikler getirebilen esnek bağlama alanlarına sahip çapa bağlayıcıları kullanılarak elde edilir ve bu da sadece ligand’a bağlı çapa bağlayıcılarını tanıyan konformasyonel seçici bağlayıcıların seçimiiçin bir temel oluşturur. Biz nanobodies cannabidiol (CBD) kaynaklı heterodimers oluşturarak bir kanıt-bir ilke gösterdi, bir 12-15 kDa fonksiyonel antikor parçası evrensel bir iskele ve üç esnek CDR döngüleri oluşan camelid gelen (Şekil 2)20, küçük molekül epitoplar için uyarlanabilir boyutları ile bağlayıcı bir cep oluşturabilirsiniz21,22. Aynı yüksek kaliteli kütüphane farklı ligandlara uygulanabildiği için, özellikle, bir kombinatoryal protein kütüphanesinin in vitro seçimi CID mühendisliği için uygun maliyetli ve genelleştirilebilir olmalıdır.
Bu protokol ve videoda, iki aşamalı in vitro seçimi ve çapa doğrulamasını(Şekil 3A)ve dimerizasyon bağlayıcılarının(Şekil 3B)tanımlanmasına odaklanarak, birleştirici nanobody kütüphanesini hedef olarak CBD kullanarak 109’dan daha yüksek bir çeşitlilikle taramaya odaklanır, ancak protokol diğer protein kütüphaneleri veya küçük moleküllü hedefler için geçerli olmalıdır. CID bağlayıcılarının taranması genellikle 6-10 hafta sürer(Şekil 4).
Farklı biyopanning turları için giriş faj kitaplıklarının doğru konsantrasyonlarını seçmek çok önemlidir. Biz genellikle ~ 1012-10 13 faj parçacıkları bir çeşitlilik >109ile bir giriş kütüphane başladı , her faj klonu ~ 100-1.000 kopya pull-down test sunulacak izin. Bağlayıcı bir kontrolde faj konsantrasyonu çok yüksek veya düşükse, spesifik olmayan bağlanma veya pozitif klonların kaybı olasılığı artacaktır. Çapa veya dimerization bağlayıcı seçi…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Washington Üniversitesi İnovasyon Ödülü (L.G.’ye), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (1R35GM128918’den L.G.’ye) ve Washington Üniversitesi’nin (L.G.)’ye bir başlangıç fonu tarafından desteklendi. H.J. Washington Araştırma Vakfı lisans bursu ile desteklendi. K.W., Washington Üniversitesi Protein Tasarımı Enstitüsü’nden lisans bursu ile desteklenmiştir.
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |