Summary

Bir Kombinatoryal Tek Etki Alanı Antikor Kütüphanesi adım wise Faj Seçimi ile Son Derece Spesifik Kimyasal Kaynaklı Protein Dimerization Sistemleri Oluşturma

Published: January 14, 2020
doi:

Summary

Herhangi bir küçük molekül ligand için istenilen yakınlık ve özgüllük ile kimyasal kaynaklı protein dimerizasyon sistemleri oluşturma birçok biyolojik algılama ve harekete uygulama olacaktır. Burada, faj la görüntülenen tek etki alanı antikor kütüphanesinin adım adım seçimi yoluyla kimyasal olarak indüklenen dimerizasyon sistemlerinin de novo mühendisliği için etkili, genelleştirilebilir bir yöntemi tanımlıyoruz.

Abstract

Sadece küçük moleküllü bir ligand varlığında meydana gelen protein dimerizasyon olayları, biyolojik yolların diseksiyonu ve manipülasyonu için küçük moleküllü biyosensörlerin geliştirilmesini sağlar. Şu anda, kimyasal olarak indüklenen dimerization (CID) sistemlerinin sadece sınırlı sayıda var ve belirli küçük moleküllü ligandlar için istenilen duyarlılık ve seçicilik ile mühendislik yenileri protein mühendisliği alanında bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada yüksek bir iş-iş tarama yöntemi, combinatorial binders-enabled sseçim CID (COMBINES-CID), cid sistemlerinin de novo mühendislik ligands büyük bir çeşitlilik için geçerli dir. Bu yöntem, ilk ilgi bir ligand ve daha sonra 2) “dimerization bağlayıcılar” sadece bağlantı bağlayıcı-ligand kompleksleri bağlamak bağlamak 1) “çapa bağlayıcıları” elde etmek için bir faj görüntülenen kombinatoryal nanobody kütüphane iki adımlı seçim kullanır. Çapa bağlayıcılarını seçmek için,10’dan fazla 9 tamamlayıcılık belirleyici bölgeden (CDR) randomize nanocisi olan bir kombinatoryal kütüphane biyotinylated ligand ile taranır ve isabetler biyo-katman interferometrisi (BLI) ile etiketlenmemiş ligand ile doğrulanır. Dimerization bağlayıcıları elde etmek için, nanobody kitaplığı pozitif tarama için hedef olarak çapa bağlayıcı-ligand kompleksleri ve negatif tarama için bağlanmamış çapa bağlayıcıları ile taranır. BİrLEŞTİrME-CID, diğer immünglobulin, immünoglobulin olmayan veya ilaç, metabolitler, sinyal molekülleri vb in vitro ve in vivo algılama için biyosensörler oluşturmak için hesaplamalı olarak tasarlanmış iskeleler ile cid bağlayıcıları seçmek için geniş uygulanabilir.

Introduction

Cid sistemleri, hangi iki protein sadece küçük moleküllü ligand varlığında dimerize (Şekil 1), diseksiyon ve metabolik manipüle için çok yönlü araçlar sunuyoruz, sinyal, ve diğer biyolojik yollar1. Onlar biyolojik aktüasyon potansiyelini göstermiştir, ilaç kontrollü T hücre aktivasyonu gibi2 ve apoptosis3,4,benimseyen T hücre tedavisinin güvenliği ve etkinliğini artırmak için. Ayrıca, küçük moleküllü hedeflerin in vivo veya in vitro tespiti için yeni bir metodoloji sağlarlar. Örneğin, CID proteinleri genetik olarak floresan muhabir sistemleri (örneğin, floresan rezonans enerji transferi (FRET)5 ve dairesel olarak permuted floresan proteinler)6 ile gerçek zamanlı in vivo ölçümler için eritilebilir veya sandviç enzimbağlantılı immünosorbent tahlil (ELISA) benzeri tahliller için yakınlık reaktifleri olarak hizmet verebilir.

Geniş uygulamalarına rağmen, belirli bir küçük moleküllü ligand tarafından kontrol edilebilen yeni CID sistemlerinin oluşturulması büyük zorluklara sahiptir. Hayvan bağışıklama dahil olmak üzere kurulan protein bağlayıcı mühendislik yöntemleri7, in vitro selection8,9, ve hesaplamalı protein tasarımı10 ikili protein-ligand etkileşimleri ile işlev ligand bağlayıcı proteinler üretebilir. Ancak, bu yöntemler ligand kaynaklı üçüncü CID kompleksi oluşturmakta güçlük sahiptir. Bazı yöntemler kimyasal olarak aynı veya farklıproteinler11, 12,13,14,15,16 bağlamak veya önceden varolan küçük molekül-protein kompleksleri 17 hedefleyen antikorlar gibi bağlayıcı proteinleri seçerek güveniki ligandlar bağlayarak CID oluşturmak17,18, ve böylece ligands sınırlı bir seçim var.

Cid sistemlerinin de novo mühendisliği için cid (COMBINES-CID) yönteminin combinatorial binders-enabled sseçim geliştirdik19. Bu yöntem, ligand kaynaklı dimerizasyon yüksek özgüllük elde edebilirsiniz (örneğin, bir çapa-dimerization bağlayıcı dissosilasyon sabiti, KD (ligand olmadan)KD (ligand ile) > 1.000). Dimerizasyon özgüllüğü, ligand bağlama üzerine konformasyonel değişiklikler getirebilen esnek bağlama alanlarına sahip çapa bağlayıcıları kullanılarak elde edilir ve bu da sadece ligand’a bağlı çapa bağlayıcılarını tanıyan konformasyonel seçici bağlayıcıların seçimiiçin bir temel oluşturur. Biz nanobodies cannabidiol (CBD) kaynaklı heterodimers oluşturarak bir kanıt-bir ilke gösterdi, bir 12-15 kDa fonksiyonel antikor parçası evrensel bir iskele ve üç esnek CDR döngüleri oluşan camelid gelen (Şekil 2)20, küçük molekül epitoplar için uyarlanabilir boyutları ile bağlayıcı bir cep oluşturabilirsiniz21,22. Aynı yüksek kaliteli kütüphane farklı ligandlara uygulanabildiği için, özellikle, bir kombinatoryal protein kütüphanesinin in vitro seçimi CID mühendisliği için uygun maliyetli ve genelleştirilebilir olmalıdır.

Bu protokol ve videoda, iki aşamalı in vitro seçimi ve çapa doğrulamasını(Şekil 3A)ve dimerizasyon bağlayıcılarının(Şekil 3B)tanımlanmasına odaklanarak, birleştirici nanobody kütüphanesini hedef olarak CBD kullanarak 109’dan daha yüksek bir çeşitlilikle taramaya odaklanır, ancak protokol diğer protein kütüphaneleri veya küçük moleküllü hedefler için geçerli olmalıdır. CID bağlayıcılarının taranması genellikle 6-10 hafta sürer(Şekil 4).

Protocol

1. Kütüphane inşaatı Daha önceaçıklandığıgibi ~ 1.23-7.14 x 109bir çeşitlilik ile sentetik bir kombinatoryal tek etki alanı antikor kütüphanesi kullanın. Bu protokol kitaplık oluşturma içermez, ancak diğer birleştirici bağlayıcı kitaplıklara uygulanabilir. 2. Ligand hedef veya ligand biyotinylation Seçilen ligand biyotinylate, örneğin, CBD ve tetrahidrokanabinol (THC)19, çeşitli k…

Representative Results

CbD’yi hedef olarak kullanarak 109’dan daha yüksek bir çeşitlilikle kombinatoryal nanobody kütüphanesini taratarak çapa ve dimerizasyon bağlayıcılarının iki aşamalı in vitro seçimi ve doğrulanmasını tanımlıyoruz. Hem çapa hem de dimerizasyon bağlayıcıları için birbirini izleyen seçim turları sırasında faj biyopannasyonunun zenginleştirilmesinin değerlendirilmesi önemlidir. Şekil 5’te gösterildiği gibi 4-6 tur seçimden sonraki tipik zenginleştir…

Discussion

Farklı biyopanning turları için giriş faj kitaplıklarının doğru konsantrasyonlarını seçmek çok önemlidir. Biz genellikle ~ 1012-10 13 faj parçacıkları bir çeşitlilik >109ile bir giriş kütüphane başladı , her faj klonu ~ 100-1.000 kopya pull-down test sunulacak izin. Bağlayıcı bir kontrolde faj konsantrasyonu çok yüksek veya düşükse, spesifik olmayan bağlanma veya pozitif klonların kaybı olasılığı artacaktır. Çapa veya dimerization bağlayıcı seçi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Washington Üniversitesi İnovasyon Ödülü (L.G.’ye), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden (1R35GM128918’den L.G.’ye) ve Washington Üniversitesi’nin (L.G.)’ye bir başlangıç fonu tarafından desteklendi. H.J. Washington Araştırma Vakfı lisans bursu ile desteklendi. K.W., Washington Üniversitesi Protein Tasarımı Enstitüsü’nden lisans bursu ile desteklenmiştir.

Materials

1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. . The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Play Video

Cite This Article
Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

View Video