Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial
Summary
Criar sistemas quimicamente induzidos da dimerização da proteína com afinidade e especificidade desejadas para toda a ligand pequena da molécula dada teria muitas aplicações biológicas da detecção e do atuação. Aqui, descrevemos um método eficiente e generalizável para a engenharia de novo de sistemas de dimerização quimicamente induzidos através da seleção manada de uma biblioteca de anticorpos combinatorial de domínio combinatório exibida por fago.
Abstract
Eventos de imersão de proteínas que ocorrem apenas na presença de um ligand de molécula pequena permitem o desenvolvimento de biossensores de pequenas moléculas para a dissecação e manipulação de vias biológicas. Atualmente, apenas um número limitado de sistemas de dimerização quimicamente induzida (CID) existe e engenharia de novos com sensibilidade desejada e seletividade para ligantes específicos de pequenas moléculas continua a ser um desafio no campo da engenharia de proteínas. Nós aqui descrevemos um método de triagem de alta produtividade, combin binders-enabled seleição de CID (COMBINES-CID), para a engenharia de novo de sistemas CID aplicável a uma grande variedade de ligantes. Este método usa a seleção em duas etapas de uma biblioteca de nanobody combinatória exibida por fago para obter 1) “pastas de âncora” que primeiro se ligam a um ligand de interesse e, em seguida, 2) “pastas de imersão” que só se ligam a complexos de ligand de pasta de ancoragem. Para selecionar pastas de âncora, uma biblioteca combinatória de mais de 109 nanobodies randomizados de complementaridade (CDR) é rastreada com um ligande biotinylated e os hits são validados com o ligand não rotulado pela interferometria de camada biológica (BLI). Para obter pastas de imersão, a biblioteca nanobody é rastreada com complexos de ligand escora como alvos para triagem positiva e as pastas de âncora sem limites para triagem negativa. Combines-CID é amplamente aplicável para selecionar pastas CID com outras imunoglobulina, não imunoglobulina, ou andaimes computacionalmente concebidos para criar biossensores para a detecção in vitro e in vivo de drogas, metabólitos, moléculas de sinalização, etc.
Introduction
Os sistemas CID, nos quais duas proteínas se dinamizarapenas na presença de um ligand de molécula pequena (Figura 1),oferecem ferramentas versáteis para dissecar e manipular vias metabólicas, sinalização e outras vias biológicas1. Eles demonstraram o potencial na atuação biológica, como a ativação de células T controladas por drogas2 e a apoptose3,4,para melhorar a segurança e eficácia da terapia de células T adotivas. Além disso, eles fornecem uma nova metodologia para a detecção in vivo ou in vitro de alvos de pequenas moléculas. Por exemplo, as proteínas CID podem ser geneticamente fundidas com sistemas de repórter de fluorescência (por exemplo, transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET)5 e proteínas fluorescentes permutadas circularmente)6 para medições in vivo em tempo real, ou servir como reagentes de afinidade para ensaios imunosordobrados ligados a enzimas sanduíches (ELISA).
Apesar de suas amplas aplicações, a criação de novos sistemas CID que podem ser controlados por um dado ligand de pequenas moléculas tem grandes desafios. Métodos estabelecidos de engenharia de pasta de proteínas, incluindo imunização animal7,seleção in vitro8,9,e design computacional deproteína10 podem gerar proteínas de ligação que funcionam através de interações binárias de proteína-ligand. No entanto, esses métodos têm dificuldades em criar um complexo cid ternary induzido por ligand. Alguns métodos criam CID ligando quimicamente dois ligantes que se ligam independentemente às mesmas ou diferentes proteínas11,12,13,14,15,16 ou dependem da seleção de proteínas de pasta, como anticorpos que visam complexos pré-existentes de pequenas moléculas e proteínas17,18,e, portanto, têm uma escolha limitada de ligantes.
Recentemente desenvolvemos um método de bin dersbin ders-e nabled de CID (COMBINES-CID) método para engenharia de novo de sistemas CID19. Este método pode obter a alta especificidade da dimerização induzida por ligand (por exemplo, uma constante de dissociação da pasta de escorização âncora, KD (sem ligand)/KD (com ligand) > 1.000). A especificidade da imersão é alcançada usando pastas de âncora com locais de ligação flexíveis que podem introduzir mudanças conformais sobre a ligação, fornecendo uma base para a seleção de pastas conformaçãoseletivas que reconhecem apenas pastas de âncora ligadas. Demonstramos uma prova de princípio criando heterodimers induzidos por canabidiol (CBD) de nanobodies, um fragmento de anticorpo funcional de 12-15 kDa de camelid compreendendo um andaime universal e três loops cdr flexíveis (Figura 2)20, que podem formar um bolso de ligação com tamanhos adaptáveis para epitopes de pequenas moléculas21,22. Notavelmente, a seleção in vitro de uma biblioteca de proteína combinatória deve ser rentável e generalizável para a engenharia CID porque a mesma biblioteca de alta qualidade pode ser aplicada a diferentes ligantes.
Neste protocolo e vídeo, nos concentramos em descrever a seleção de duas etapas in vitro e validação de âncora(Figura 3A)e pastas de imersão(Figura 3B),selecionando a biblioteca nanobody combinatória com uma diversidade superior a 109 usando CBD como alvo, mas o protocolo deve ser aplicável a outras bibliotecas de proteínas ou alvos de pequenas moléculas. A triagem de pastas CID geralmente leva 6-10 semanas(Figura 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
É fundamental escolher as concentrações corretas de bibliotecas de fagos de entrada para diferentes rodadas de biopanning. Nós normalmente começou a partir de uma biblioteca de entrada de ~ 1012-1013 partículas de fago com uma diversidade >109, permitindo ~ 100-1.000 cópias de cada clone fago para ser apresentado no ensaio pull-down. Se a concentração de fagos em um ensaio vinculativo for muito alta ou baixa, a probabilidade de ligação inespecífica ou perda de clones positivos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Inovação da Universidade de Washington (para a L.G.), uma doação dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (1R35GM128918 para a L.G.), e um fundo de startups da Universidade de Washington (para l.G.). H.J. foi apoiado por uma bolsa de graduação da Washington Research Foundation. K.W. foi apoiado por uma bolsa de graduação do Instituto de Design de Proteínas da Universidade de Washington.
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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