Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Los sistemas CID, en los que dos proteínas dimerize sólo en presencia de un ligando de moléculas pequeñas(Figura 1),ofrecen herramientas versátiles para disecar y manipular vías metabólicas, de señalización y otras vías biológicas¹. Han demostrado el potencial en el accionamiento biológico, como la activación de células T controlada por fármacos² y la apoptosis^3,4,para mejorar la seguridad y eficacia de la terapia adoptiva de células T. Además, proporcionan una nueva metodología para la detección in vivo o in vitro de objetivos de moléculas pequeñas. Por ejemplo, las proteínas CID pueden fusionarse genéticamente con sistemas de reporteros de fluorescencia (por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)⁵ y proteínas fluorescentes permutadas circularmente)⁶ para mediciones in vivo en tiempo real, o servir como reactivos de afinidad para ensayos similares a inmunoabsorbentes ligados a enzimas sándwich (ELISA).

A pesar de sus amplias aplicaciones, la creación de nuevos sistemas CID que pueden ser controlados por un ligando de moléculas pequeñas determinado tiene grandes desafíos. Los métodos establecidos de ingeniería de aglutinantes de proteínas, incluida la inmunización animal⁷, la selección in vitro^8,9,y el diseño de proteínas computacionales¹⁰ pueden generar proteínas de unión de ligando que funcionan a través de interacciones binarias proteína-ligand. Sin embargo, estos métodos tienen dificultades para crear un complejo de CID ternario inducido por ligando. Algunos métodos crean CID mediante la vinculación química de dos ligandos que se unen de forma independiente a las mismas o diferentes proteínas^{11,12,13,14,15,16} o dependen de la selección de proteínas aglutinantes como anticuerpos dirigidos a pequeños complejos de moléculas-proteínas preexistentes^17,18, y por lo tanto tienen una opción limitada de ligandos.

Recientemente desarrollamos un método de ingeniería denovo de los sistemas CID^19. Este método puede obtener la alta especificidad de la dimerización inducida por ligando (por ejemplo, una constante de disociación de aglutinante de anclaje-dmerización, K_D (sin ligando) /K_D (con ligando) > 1.000). La especificidad de la dimerización se logra utilizando aglutinantes de anclaje con sitios de unión flexibles que pueden introducir cambios de conformación sobre la unión de ligandos, proporcionando una base para la selección de aglutinantes selectivos de conformación que sólo reconocen aglutinantes de anclaje ligandos. Demostramos una prueba de principio mediante la creación de heterodímeros inducidos por cannabidiol (CBD) de nanocuerpos, un fragmento de anticuerpo funcional de 12-15 kDa de camión que comprende un andamio universal y tres bucles CDR flexibles(Figura 2)^20,que pueden formar un bolsillo de unión con tamaños adaptables para epítopos de moléculas pequeñas^21,22. En particular, la selección in vitro de una biblioteca de proteínas combinatorias debe ser rentable y generalizable para la ingeniería CID, ya que la misma biblioteca de alta calidad se puede aplicar a diferentes ligandos.

En este protocolo y vídeo, nos centramos en describir la selección y validación in vitro en dos pasos del anclaje(Figura 3A)y los aglutinantes de dimerización(Figura 3B)mediante la selección de la biblioteca combinatorial de nanobody con una diversidad superior a 10⁹ utilizando el CBD como objetivo, pero el protocolo debe ser aplicable a otras bibliotecas de proteínas o objetivos de moléculas pequeñas. El cribado de aglutinantes CID suele tardar de 6 a 10 semanas(Figura 4).