通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统
Summary
对于任何给定的小分子配体，创建具有所需亲和力和特异性的化学诱导蛋白二聚系统将具有许多生物传感和驱动应用。在这里，我们描述了一种有效的、可通用的方法，通过逐步选择噬菌体显示的组合单域抗体库来对化学诱导的二聚系统进行新工程。
Abstract
仅在小分子配体存在的情况下发生的蛋白质二聚化事件使小分子生物传感器得以发展，用于解剖和操作生物途径。目前，只有有限数量的化学诱导的二聚体（CID）系统存在，并设计具有特定小分子配体的所需灵敏度和选择性的新系统仍然是蛋白质工程领域的一个挑战。我们在这里描述了一种高通量筛选方法，即一种适用于各种配体的CID系统的”新设计”，即CID（联合体）的选配型。此方法使用噬菌体显示的组合 nanobody 库的两步选择来获得 1） “锚活页夹”，首先绑定到感兴趣的配体，然后 2） 仅绑定到锚结物-配体复合物的”二聚体粘结剂”。为了选择锚固粘合剂，使用生物素化配体筛选出超过109个互补性决定区域（CDR）随机纳米体的组合库，并通过生物层干涉法（BLI）对未标记的配体进行验证。为了获得二分化活页夹，nanobody 库筛选了锚活页夹-配体复合物，作为正筛选的目标，未绑定的锚活页夹用于负筛选。ORS-CID广泛适用于选择具有其他免疫球蛋白、非免疫球蛋白或计算设计的支架的CID粘合剂，以创建用于体外和体内检测药物、代谢物、信号分子等的生物传感器。
Introduction
CID系统，其中两种蛋白质仅在小分子配体存在的情况下进行分化（图1），为解剖和操纵代谢、信号和其他生物途径1提供了多功能的工具。他们已经证明了在生物驱动方面的潜力，如药物控制的T细胞活化2和凋亡3，4，以提高采用T细胞治疗的安全性和有效性。此外，它们为体内或体外小分子靶点检测提供了新方法。例如，CID 蛋白可与荧光报告系统（例如荧光共振能量转移 （FRET）5和循环渗透荧光蛋白6进行基因融合，用于实时体内测量，或用作三明治酶链接免疫吸附剂测定 （ELISA） 样的亲和力试剂。
尽管其应用广泛，但创建新的 CID 系统（可通过给定的小分子配体控制）面临重大挑战。已建立的蛋白质粘合剂工程方法包括动物免疫7、体外选择8、9和计算蛋白设计10，可以产生通过二元蛋白-配体相互作用起作用的配体结合蛋白。然而，这些方法很难创建配体引起的三元CID复合物。有些方法通过化学连接两个独立结合相同或不同蛋白质11、12、13、14、15、16的配体而创建CID，或者依靠选择粘合剂蛋白，如针对预先存在的小分子蛋白复合物17、18的抗体，因此配体选择有限。
我们最近开发了一种用于CID系统19的”新工程”的CID（联合体-CID）方法。 该方法可以获得配体诱导的二分化的高特异性（例如，锚点-二聚体解散常数，KD（不含配体）/KD（配体）>1，000）。二聚化特异性是使用具有柔性结合位点的锚点，可在配体结合时引入构象变化，为仅识别配体结合锚活页夹的构象选择性活页夹的选择提供基础。通过创建纳米体大麻二醇（CBD）诱导异体体，从camelid中形成12-15 kDa功能抗体片段，包括一个通用支架和三个灵活的CDR回路（图2）20，从而形成一个可适应小分子表位21、22的结合口袋，从而证明了一种原理证明。值得注意的是，组合蛋白库的体外选择对于CID工程来说应该是经济高效和可通用的，因为相同的高质量库可以应用于不同的配体。
在本协议和视频中，我们重点描述了锚（图3A）和二聚体粘合剂（图3B）的两步体外选择和验证，通过筛选多样性大于109的组合nanobody库，以CBD为目标，但该协议应适用于其他蛋白质库或小分子靶点。CID活页夹的筛选通常需要6~10周（图4）。
Protocol
Representative Results
Discussion
为不同轮的生物泛性选择正确浓度的输入噬菌体库至关重要。我们通常从 #1012#1013噬菌体颗粒的输入库开始，其多样性 >109，允许在下拉测定中呈现每个噬菌体克隆的 100~1，000 份拷贝。如果结合测定中的噬菌体浓度过高或过低，则非特异性结合或阳性克隆损失的可能性将增加。锚点或二聚体粘结剂选择通常包括三到六轮生物盘化，输出噬菌体计数通常从 +104开始，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了华盛顿大学创新奖（L.G.）的资助，美国国家卫生研究院（1R35GM128918到L.G.）的资助，以及华盛顿大学（L.G.）的启动基金。H.J.得到了华盛顿研究基金会本科生奖学金的支持。K.W.得到了华盛顿大学蛋白质设计研究所的本科奖学金的支持。
Materials
| 1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) | Millipore | UFC900324 | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| Bio-Rad Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000002 | |
| BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1KG | |
| CM13 Helper phage | Antibody Design Labs | PH020L | |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Alfa Aesar | A11090 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | BP120-1 | |
| Fast DNA Ladder | New England Biolabs | N3238S | |
| FastDigest BglI | Thermo Fisher Scientific | FD0074 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-1 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 28989335 | |
| HiPrep 26/10 Desalting Column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HisTrap-FF-1ml | GE Healthcare | 11000458 | |
| Imidazole | Alfa Aesar | 161-0718 | |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 34060 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher Scientific | BP906-5 | |
| M13 Major Coat Protein Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53004 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500G | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates | Thermo Fisher Scientific | 260251 | |
| Nunc MaxiSorp | Thermo Fisher Scientific | 44-2404-21 | |
| Octet RED96 | ForteBio | N/A | |
| pADL-23c Phagemid Vector | Antibody Design Labs | PD0111 | |
| PEG-6000 | Sigma-Aldrich | 81260-1KG | |
| Platinum SuperFi DNA Polymerase | Invitrogen | 12351010 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Thermo Fisher Scientific | K310001 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 27704 | |
| Recovery Medium | Lucigen | 80026-1 | |
| SpectraMax Plus 384 | Molecular Devices | N/A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | |
| Super Streptavidin (SSA) Biosensors | ForteBio | 18-5057 | |
| Superdex 75 increase 10/300 GL Column | GE Healthcare | 28-9909-44 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | 15224-025 | |
| TG1 Electrocompetent Cells | Lucigen | 60502-1 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283-100mL | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | BP9726-5 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89882 |
References
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