Expresión, purificación y encuadernación liposoma de los heterodímeros SNX-BAR de levadura en ciernes

Los orgánulos ligados a la membrana como la membrana plasmática, el retículo endoplasmático, el aparato Golgi, el lisosoma (vacuole de levadura) y el endosoma comprenden el sistema endomembrana de la célula eucariota. La mayoría de los orgánulos tienen la capacidad de comunicarse e intercambiar material con otros orgánulos a través de portadores de transporte vesícula. No se entiende bien cómo la célula coordina el envasado y la formación de portadores de transporte de vesículas dentro del sistema de endomembrana. Sin embargo, se sabe que las proteínas y lípidos que constituyen gran parte del sistema de endomembrana se originan a partir de vesículas endoccíticas internalizadoras de la membrana plasmática (PM). El endosoma es el principal orgánulo aceptador para estas vesículas y se compone de múltiples conjuntos interconectados de orgánulos tubulares. La función principal del endosoma es facilitar la adquisición de nutrientes, regular la rotación de proteínas y lípidos, proteger de la infección de patógenos y servir como la principal fuente de reposición de lípidos para la membrana plasmática. Como el endosoma recibe la mayor parte de proteínas de carga y lípidos de la membrana plasmática, actúa como un compartimento de clasificación mediante el aíslamiento de cargas en los transportadores endosómicos tubulares (ETC). Cualquier proteína que no se secuestre en los ETCs se deja degradar a través del sistema endo-lisosomal. La desregulación de la clasificación de carga en ETCs puede conducir a la pérdida de la sutoma de nutrientes, rotación de proteínas o homeostasis lipídica, lo que resulta en numerosos trastornos metabólicos, de desarrollo y neurológicos^1,2. Sin embargo, a pesar del papel central de los CTE en el endosoma, no se conoce el mecanismo subyacente de cómo el endosoma puede coordinar selectivamente el empaquetado de una multitud de cargas heterogéneas en portadores tubulares.

La familia de nexina de clasificación (SNX) es una clase evolutivamente conservada de proteínas que se han encontrado críticas para muchas reacciones de transporte vesícula en la celda^3,4,5. Los nexinos de clasificación se reclutan para la membrana endosoma y ayudan en la captura de carga a través de su característico dominio de la homología phox (PX), que une el fosfatidilinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lípido enriquecido en la membrana endosoma. Los mamíferos codifican treinta y tres proteínas SNX, que se pueden dividir en múltiples subfamilias, según la presencia de otros dominios¹. Más notablemente, la subfamilia SNX-BAR es la subfamilia más grande que consta de doce en humanos, mientras que en levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae, la subfamilia se reduce a sólo siete SNX-BARs. Las proteínas SNX-BAR tienen un dominio PX y un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) que activa los reservorios lipídis para unir curvaturas positivas. En consecuencia, la familia SNX-BAR tiene una afinidad natural por el endosoma y puede mediar la formación de ETC a través de sus capacidades de remodelación de membrana. In vitro, las propiedades de remodelación de sNX-BARs pueden ser inducidas por la adición de SNX-BARpurificados a liposomas sintéticos y la posterior formación de túbulos estrechos y recubiertos se puede visualizar mediante microscopía electrónica. Utilizando estos métodos, los investigadores han determinado que tanto la concentración de oligomerización como la fuerza de constricción parecen variar entre la familia SNX-BAR, lo que sugiere que podrían ayudar tanto en la formación como en la cissión de los CTE.

Los SNX-BARs se pueden clasificar aún más por sus propiedades exclusivas de dimerización. Los ensayos de unión in vitro y los estudios estructurales han demostrado que las proteínas SNX-BAR sólo pueden formar homodímeros o heterodímeros específicos. Por lo tanto, en principio, cada potencial dimer-oligomero SNX-BAR podría proporcionar una capa de túbulo para una vía de tráfico específica de carga y, del mismo modo, la oligomerización restringida de los otros protomeros SNX-BAR, también puede definir distintas vías de exportación. Sin embargo, debido al gran número de SNX-BARs y diversidad dentro de la familia SNX, una hipótesis de carga nexin-one de clasificación es altamente improbable. En su lugar, es más probable un esfuerzo coordinado utilizando una multitud de factores como SNX-BARs, carga, especificidad lipídica y otras dependencias. Asimismo, estudios recientes de la familia de levaduras SNX4 revelaron evidencia de especificidad lipídica adicional, más allá de PtdIns(3)P, para potenciar los^portadoresde transporte endosoma6. En este estudio, el homodimer SNX-BAR Mvp1-Mvp1 fue purificado a partir de bacterias y heterodímeros nativos Snx4-Atg20 y Vps5-Vps17 fueron expresados y purificados en alto rendimiento de la levadura, mientras que sólo Snx4-Atg20 se encontró para unir preferentemente fosfatidilserina (PS) y formar estructuras estrechas tipo tubo en estudios de unión liposoma⁶. Mientras que otros en el campo han revelado importantes propiedades de los SNX-BARs utilizando homodímeros SNX-BAR purificados recombinantemente de bacterias, toxicidad asociada con la expresión de heterodímeros SNX-BAR en sistemas similares han obstaculizado su caracterización nativa^7,8,9,10. Por lo tanto, sin un sistema confiable para obtener heterodímeros nativos expresados recombinantemente puros, los investigadores deben renunciar a estas líneas de investigación. En la Figura 1, presentamos un flujo de trabajo de cuatro partes para 1) construir una cepa de levadura sobreexpresando heterodímeros SNX-BAR para purificación de afinidad en tándem, 2) expresar y purificar heterodímeros nativos SNX-BAR, 3) preparar liposomas sintéticos unilamellares, y 4) establecer un ensayo de tubulación liposoma o sedimentaciones, proporcionando una herramienta vital para que los investigadores investiguen el creciente catálogo de nexinos de clasificación encontrados en la naturaleza.