Espressione, purificazione e rilegatura lipososo di eterodimeri SNX-BAR

Gli organelli legati a membrane come la membrana plasmatica, il reticolo endoplasmico, l’apparato Golgi, il lisosoma (vacuolo di lievito) e l’endosoma costituiscono il sistema endomembrano della cellula eucabolica. La maggior parte degli organelli ha la capacità di comunicare e scambiare materiale con altri organelli attraverso vettori di trasporto vescicolo. Il modo in cui la cellula coordina l’imballaggio e la formazione di vettori di trasporto vescicolo all’interno del sistema endomembrana non è ben compreso. Tuttavia, le proteine e i lipidi che costituiscono gran parte del sistema dell’endomembrana sono noti per provenire dall’interiorizzazione delle vesciche endocitiche dalla membrana plasmatica (PM). L’endosoma è l’organello accettatore primario per queste vescicle ed è composto da più set interconnessi di organelli tubolari. La funzione principale dell’endosoma è quella di facilitare l’acquisizione di nutrienti, regolare il turnover di proteine e lipidi, proteggere dall’infezione patogena e fungere da fonte primaria di rifornimento di lipidi per la membrana plasmatica. Poiché l’endosoma riceve la maggior parte delle proteine del carico e dei lipidi dalla membrana plasmatica, agisce come un compartimento di smistamento isolando i carichi in vettori di trasporto endosomici tubolari (ETC). Tutte le proteine non sequestrate negli ETC vengono lasciate degradare attraverso il sistema endososomico. La disregolazione dello smistamento del carico negli ETC può portare alla perdita di assorbimento di nutrienti, turnover proteico o omeostasi lipidica, con conseguente numerosa disturbi metabolici, di sviluppo e neurologici^1,2. Tuttavia, nonostante gli ETC ruolo centrale presso l’endosoma, il meccanismo sottostante di come l’endosoma può coordinare selettivamente l’imballaggio di una moltitudine di carichi eterogenei in vettori tubolari non è noto.

La famiglia di nexin a cinta (SNX) è una classe evolutivamente conservata di proteine che sono state trovate critiche per molte reazioni di trasporto vescicle nella cella^3,4,5. Le nexine di smistamento vengono reclutate nella membrana endosomicosa e aiutano nella cattura del carico attraverso il loro caratteristico dominio di omologia fox (PX), che lega fosfatoylinostolo-3-monofosfato (PtdIns(3)P), un lipido arricchito sulla membrana endosoma. I mammiferi codificano trentatré proteine SNX, che possono essere ulteriormente suddivise in più sottofamiglie, in base alla presenza di altri domini¹. In particolare, la sottofamiglia SNX-BAR è la più grande sottofamiglia composta da dodici in umani, mentre in lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, la sottofamiglia è ridotta a soli sette SNX-BAR. Le proteine SNX-BAR hanno sia un dominio PX che un dominio Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR) che attiva serbatoi lipidici per legare membrane di curvatura positive. Di conseguenza, la famiglia SNX-BAR ha una naturale affinità per l’endosoma e può mediare la formazione etc attraverso le loro capacità di rimodellamento della membrana. In vitro, le proprietà di rimodellamento delle SNX-BAR possono essere indotte dall’aggiunta di SNX-BAR purificati ai liposomi sintetici e la successiva formazione di tubuli stretti e rivestiti può essere visualizzata mediante microscopia elettronica. Utilizzando questi metodi, i ricercatori hanno determinato che sia la concentrazione di oligomerizzazione che la forza di costrizione sembrano variare tra la famiglia SNX-BAR suggerendo che potrebbero aiutare sia nella formazione che nella scissione degli ETC.

Gli SNX-BAR possono essere ulteriormente classificati in base alle loro esclusive proprietà di dimerizzazione. I saggi e gli studi strutturali che legano in vitro che le proteine SNX-BAR possono formare solo omodimeri o eterodimeri specifici. Pertanto, in linea di principio, ogni potenziale dimero-oligomero SNX-BAR potrebbe fornire un rivestimento tubulo per un percorso di traffico specifico del carico e, allo stesso modo, l’oligomerizzazione limitata degli altri protomeri SNX-BAR, può anche definire percorsi di esportazione distinti. Tuttavia, a causa del gran numero di SNX-BAR e della diversità all’interno della famiglia SNX, una specifica che smista l’ipotesi del carico nexin-one è altamente improbabile. Invece uno sforzo coordinato utilizzando una moltitudine di fattori come SNX-BAR, carico, specificità lipidica e altre dipendenze è più probabile. Allo stesso modo, recenti studi della famiglia lievito SNX4 hanno rivelato prove di ulteriore specificità dei lipidi, oltre PtdIns(3)P, per potenziare i vettori di trasporto endosomi⁶. In questo studio, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 è stato purificato da batteri e eterodimeri nativi Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 sono stati espressi e purificati in alta resa da lievito, mentre solo Snx4-Atg20 è stato trovato per legare preferibilmente phosphatidylserine (PS) e formare stretta-tubo come le strutture di legame^6. Mentre altri nel campo hanno rivelato importanti proprietà delle SNX-BAR utilizzando omodimeri SNX-BAR ricombinanti purificati dai batteri, la tossicità associata all’espressione di eterodimeri SNX-BAR in sistemi simili hanno ostacolato la loro caratterizzazione nativa^7,8,9,10. Pertanto, senza un sistema affidabile per ottenere eterodimeri nativi puramente espressi in modo ricombinante, i ricercatori devono rinunciare a queste linee di indagine. Nella Figura 1, presentiamo un flusso di lavoro in quattro parti a 1) costruire un ceppo di lievito sovraesprimendo eterodimeri SNX-BAR per la purificazione dell’affinità tandem, 2) esprimere e purificare gli eterodimeri nativi SNX-BAR, 3) preparare liposomi sintetici unilamellar, e 4) impostare un sussidio di tubulazione o sedimentazioni liposomiche, fornendo uno strumento vitale per i ricercatori per studiare il crescente catalogo di retissine di smistamento presenti in natura.