Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.
As proteínas SNX-BAR são uma classe evolutivamente conservada de proteínas de remodelação da membrana que desempenham papéis fundamentais na triagem e tráfico de proteínas e lipídios durante a endocitose, classificação dentro do sistema endosômico e autofagia. Central para a função de proteína SNX-BAR é a capacidade de formar homodimers ou heterodimers que ligam membranas usando altamente conservado phox-homologia (PX) e BAR (Bin / Anfiphysin / Rvs) domínios. Além disso, a oligomerização dos dimers SNX-BAR nas membranas pode provocar a formação de túbulos e vesículas de membrana e esta atividade é pensada para refletir suas funções como proteínas de revestimento para transportadores de transporte derivados do endosome. Os investigadores têm utilizado por muito tempo estudos de ligação in vitro usando proteínas recombinantes de SNX-BAR em lipossomos sintéticos ou vesículas unilamellares gigantes (GUVs) para revelar a composição precisa dos lipids necessários para conduzir a remodelação da membrana, assim revelando seu mecanismo da ação. No entanto, devido a desafios técnicos com sistemas de dupla expressão, toxicidade da expressão de proteína SNX-BAR em bactérias e falta de solubilidade de proteínas SNX-BAR individuais, a maioria dos estudos até o momento examinaram homodimers SNX-BAR, incluindo dimers não fisiológicos que se formam durante a expressão em bactérias. Recentemente, otimizamos um protocolo para superar as principais deficiências de um sistema típico de expressão bacteriana. Usando este fluxo de trabalho, demonstramos como expressar e purificar com sucesso grandes quantidades de heterodimers SNX-BAR e como reconstituí-los em lipossomos sintéticos para ensaios de ligação e tubulação.
Organelas ligadas à membrana, como a membrana plasmática, o retículo endoplasmico, o aparelho Golgi, o lisósoma (vacuole de levedura) e o endosome compõem o sistema de endosmembrana da célula eucariótica. A maioria das organelas tem a capacidade de comunicar e trocar material com outras organelas através de transportadores de transporte de vesículas. Como a célula coordena a embalagem e formação de transportadores de transporte de vesículas dentro do sistema de endosmembrana não é bem compreendida. No entanto, as proteínas e lipídios que constituem grande parte do sistema de endosmembrana são conhecidos por se originar de internalizar vesículas endócticas da membrana plasmática (PM). O endosome é o organela principal do acceptor para estas vesículas e é compreendido de jogos interconectados múltiplos de organelas tubulares. A principal função do endosome é facilitar a aquisição de nutrientes, regular o volume de negócios de proteínas e lipídios, proteger contra a infecção por patógenos e servir como a principal fonte de reposição de lipídios para a membrana plasmática. Como o endosome recebe a maior parte das proteínas de carga e lipídios da membrana plasmática, ele atua como um compartimento de triagem, isolando as cargas em transportadores de transporte endosômico tubular (ETCs). Quaisquer proteínas não seqüecidas em ETCs são deixadas para serem degradadas através do sistema endo-lossômico. A desregulação da classificação de carga em ETCs pode levar à perda de absorção de nutrientes, rotatividade de proteínas ou homeostase lipídica, resultando em inúmeras distúrbios metabólicos, de desenvolvimento e neurológicos1,2. No entanto, apesar do papel central dos ETCs no endossômico, o mecanismo subjacente de como o endossôpode pode coordenar seletivamente a embalagem de uma infinidade de cargas heterogêneas em portadores tubulares não é conhecido.
A família de triagem nexina (SNX) é uma classe evolutivamente conservada de proteínas que foram consideradas críticas para muitas reações de transporte de vesículana na célula3,4,5. A triagem de nexinas é recrutada para a membrana endossômica e ajuda na captura de carga através de seu domínio característico de homologia foscar (PX), que liga fosphatidylinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), um lipídio enriquecido na membrana endossô. Mamíferos codificam trinta e três proteínas SNX, que podem ser ainda mais divididas em várias subfamílias, de acordo com a presença de outros domínios1. Mais notavelmente, a subfamília SNX-BAR é a maior subfamília composta por doze em humanos, enquanto no fermento em ascensão, Saccharomyces cerevisiae, a subfamília é reduzida para apenas sete SNX-BARs. As proteínas SNX-BAR têm um domínio PX e um domínio Bin-Anfiphysin-Rvs (BAR) que desencadeia reservatórios lipídicos para ligar membranas de curvatura positiva. Consequentemente, a família SNX-BAR tem uma afinidade natural com o endossôe e pode mediar a formação etc através de suas habilidades de remodelação da membrana. In vitro, as propriedades de remodelação dos SNX-BARs podem ser induzidas pela adição de SNX-BARs purificados a lipossomos sintéticos e a formação subsequente de tubulos estreitos e revestidos pode ser visualizada por microscopia eletrônica. Usando esses métodos, os pesquisadores determinaram que tanto a concentração de oligomerização quanto a força de constrição parecem variar entre a família SNX-BAR, sugerindo que eles poderiam ajudar tanto na formação quanto na scission dos ETCs.
Os SNX-BARs podem ser classificados ainda mais por suas propriedades exclusivas de dimerização. Ensaios e estudos estruturais in vitro vinculativos demonstraram que as proteínas SNX-BAR só podem formar homodimers ou heterodimers específicos. Portanto, em princípio, cada potencial dimer-oligomer SNX-BAR poderia fornecer um casaco tubule para uma via de tráfico específico de carga e, da mesma forma, a oligomerização restrita dos outros protomermers SNX-BAR, também pode definir caminhos de exportação distintos. No entanto, devido ao grande número de SNX-BARs e diversidade dentro da família SNX, uma hipótese de carga nexina-one de triagem é altamente improvável. Em vez disso, um esforço coordenado usando uma infinidade de fatores, como SNX-BARs, carga, especificidade lipídicas e outras dependências é mais provável. Da mesma forma, estudos recentes da família levedura SNX4 revelaram evidências de especificidade lipídica adicional, além de PtdIns (3)P, para potencializar transportadores de transporte endôssomo6. Neste estudo, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 foi purificado de bactérias e heterodimers nativos Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 foram expressos e purificados em alto rendimento de levedura, enquanto apenas Snx4-Atg20 foi encontrado para ligar preferencialmente phosphatidylserine (PS) e forma estreita tubo-como estruturas em estudos de ligação liposome6. Enquanto outros no campo revelaram propriedades importantes dos SNX-BARs usando homodimers SNX-BAR recombinantemente purificados de bactérias, toxicidade associada à expressão heterodimers SNX-BAR em sistemas semelhantes têm dificultado a sua caracterização nativa7,8,9,10. Portanto, sem um sistema confiável para obter heterodimers nativos recombinantemente expressos, os pesquisadores devem renunciar a essas linhas de investigação. Na Figura 1,apresentamos um fluxo de trabalho em quatro partes para 1) construímos uma cepa de levedura superexpressando heterodimers SNX-BAR para purificação de afinidade tandem, 2) expressar e purificar heterodimers nativos SNX-BAR, 3) preparar lipossomos sintéticos unilamellares, e 4) configurar uma tubulação liossoma ou ensaio sedimentações, fornecendo uma ferramenta vital para os pesquisadores para investigar o catálogo crescente de nexinos classificação encontradona natureza.
Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho otimizado para purificar os dimers SNX-BAR em levedura e dois ensaios para avaliar suas propriedades biofísicas em lipossomas sintéticos. A principal vantagem sobre a expressão típica de proteína recombinante em Escherichia coli ou outros sistemas é a capacidade de expressar uniformemente as proteínas SNX-BAR em um hospedeiro nativo, evitando assim as questões de toxicidade e insolubilidade encontradas na purificação de SNX-BARs em outros sistemas. Também é not…
The authors have nothing to disclose.
Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de premiação GM060221 e em parte pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmio T32GM007223. R.C. foi apoiado em parte pelo Programa de Bolsas de Pesquisa da Faculdade UNC-Charlotte.
0.2 micrometer PC Membranes | Avanti | 610006 | |
10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
27 Gauge needle | BD Biosciences | 301629 | |
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
BCA assay | Pierce | 23225 | |
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPS | Avanti | 840035 | |
ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL | Avanti | 610000 | |
FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 C |
Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |