Summary

Expressão, purificação e ligação lipossoma dos heterodimers brotamentos do SNX-BAR do fermento

Published: December 06, 2019
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a expressão, purificação e ligação liposoma de heterodimers SNX-BAR em levedura.

Abstract

As proteínas SNX-BAR são uma classe evolutivamente conservada de proteínas de remodelação da membrana que desempenham papéis fundamentais na triagem e tráfico de proteínas e lipídios durante a endocitose, classificação dentro do sistema endosômico e autofagia. Central para a função de proteína SNX-BAR é a capacidade de formar homodimers ou heterodimers que ligam membranas usando altamente conservado phox-homologia (PX) e BAR (Bin / Anfiphysin / Rvs) domínios. Além disso, a oligomerização dos dimers SNX-BAR nas membranas pode provocar a formação de túbulos e vesículas de membrana e esta atividade é pensada para refletir suas funções como proteínas de revestimento para transportadores de transporte derivados do endosome. Os investigadores têm utilizado por muito tempo estudos de ligação in vitro usando proteínas recombinantes de SNX-BAR em lipossomos sintéticos ou vesículas unilamellares gigantes (GUVs) para revelar a composição precisa dos lipids necessários para conduzir a remodelação da membrana, assim revelando seu mecanismo da ação. No entanto, devido a desafios técnicos com sistemas de dupla expressão, toxicidade da expressão de proteína SNX-BAR em bactérias e falta de solubilidade de proteínas SNX-BAR individuais, a maioria dos estudos até o momento examinaram homodimers SNX-BAR, incluindo dimers não fisiológicos que se formam durante a expressão em bactérias. Recentemente, otimizamos um protocolo para superar as principais deficiências de um sistema típico de expressão bacteriana. Usando este fluxo de trabalho, demonstramos como expressar e purificar com sucesso grandes quantidades de heterodimers SNX-BAR e como reconstituí-los em lipossomos sintéticos para ensaios de ligação e tubulação.

Introduction

Organelas ligadas à membrana, como a membrana plasmática, o retículo endoplasmico, o aparelho Golgi, o lisósoma (vacuole de levedura) e o endosome compõem o sistema de endosmembrana da célula eucariótica. A maioria das organelas tem a capacidade de comunicar e trocar material com outras organelas através de transportadores de transporte de vesículas. Como a célula coordena a embalagem e formação de transportadores de transporte de vesículas dentro do sistema de endosmembrana não é bem compreendida. No entanto, as proteínas e lipídios que constituem grande parte do sistema de endosmembrana são conhecidos por se originar de internalizar vesículas endócticas da membrana plasmática (PM). O endosome é o organela principal do acceptor para estas vesículas e é compreendido de jogos interconectados múltiplos de organelas tubulares. A principal função do endosome é facilitar a aquisição de nutrientes, regular o volume de negócios de proteínas e lipídios, proteger contra a infecção por patógenos e servir como a principal fonte de reposição de lipídios para a membrana plasmática. Como o endosome recebe a maior parte das proteínas de carga e lipídios da membrana plasmática, ele atua como um compartimento de triagem, isolando as cargas em transportadores de transporte endosômico tubular (ETCs). Quaisquer proteínas não seqüecidas em ETCs são deixadas para serem degradadas através do sistema endo-lossômico. A desregulação da classificação de carga em ETCs pode levar à perda de absorção de nutrientes, rotatividade de proteínas ou homeostase lipídica, resultando em inúmeras distúrbios metabólicos, de desenvolvimento e neurológicos1,2. No entanto, apesar do papel central dos ETCs no endossômico, o mecanismo subjacente de como o endossôpode pode coordenar seletivamente a embalagem de uma infinidade de cargas heterogêneas em portadores tubulares não é conhecido.

A família de triagem nexina (SNX) é uma classe evolutivamente conservada de proteínas que foram consideradas críticas para muitas reações de transporte de vesículana na célula3,4,5. A triagem de nexinas é recrutada para a membrana endossômica e ajuda na captura de carga através de seu domínio característico de homologia foscar (PX), que liga fosphatidylinositol-3-monofosfato (PtdIns(3)P), um lipídio enriquecido na membrana endossô. Mamíferos codificam trinta e três proteínas SNX, que podem ser ainda mais divididas em várias subfamílias, de acordo com a presença de outros domínios1. Mais notavelmente, a subfamília SNX-BAR é a maior subfamília composta por doze em humanos, enquanto no fermento em ascensão, Saccharomyces cerevisiae, a subfamília é reduzida para apenas sete SNX-BARs. As proteínas SNX-BAR têm um domínio PX e um domínio Bin-Anfiphysin-Rvs (BAR) que desencadeia reservatórios lipídicos para ligar membranas de curvatura positiva. Consequentemente, a família SNX-BAR tem uma afinidade natural com o endossôe e pode mediar a formação etc através de suas habilidades de remodelação da membrana. In vitro, as propriedades de remodelação dos SNX-BARs podem ser induzidas pela adição de SNX-BARs purificados a lipossomos sintéticos e a formação subsequente de tubulos estreitos e revestidos pode ser visualizada por microscopia eletrônica. Usando esses métodos, os pesquisadores determinaram que tanto a concentração de oligomerização quanto a força de constrição parecem variar entre a família SNX-BAR, sugerindo que eles poderiam ajudar tanto na formação quanto na scission dos ETCs.

Os SNX-BARs podem ser classificados ainda mais por suas propriedades exclusivas de dimerização. Ensaios e estudos estruturais in vitro vinculativos demonstraram que as proteínas SNX-BAR só podem formar homodimers ou heterodimers específicos. Portanto, em princípio, cada potencial dimer-oligomer SNX-BAR poderia fornecer um casaco tubule para uma via de tráfico específico de carga e, da mesma forma, a oligomerização restrita dos outros protomermers SNX-BAR, também pode definir caminhos de exportação distintos. No entanto, devido ao grande número de SNX-BARs e diversidade dentro da família SNX, uma hipótese de carga nexina-one de triagem é altamente improvável. Em vez disso, um esforço coordenado usando uma infinidade de fatores, como SNX-BARs, carga, especificidade lipídicas e outras dependências é mais provável. Da mesma forma, estudos recentes da família levedura SNX4 revelaram evidências de especificidade lipídica adicional, além de PtdIns (3)P, para potencializar transportadores de transporte endôssomo6. Neste estudo, SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1 foi purificado de bactérias e heterodimers nativos Snx4-Atg20 e Vps5-Vps17 foram expressos e purificados em alto rendimento de levedura, enquanto apenas Snx4-Atg20 foi encontrado para ligar preferencialmente phosphatidylserine (PS) e forma estreita tubo-como estruturas em estudos de ligação liposome6. Enquanto outros no campo revelaram propriedades importantes dos SNX-BARs usando homodimers SNX-BAR recombinantemente purificados de bactérias, toxicidade associada à expressão heterodimers SNX-BAR em sistemas semelhantes têm dificultado a sua caracterização nativa7,8,9,10. Portanto, sem um sistema confiável para obter heterodimers nativos recombinantemente expressos, os pesquisadores devem renunciar a essas linhas de investigação. Na Figura 1,apresentamos um fluxo de trabalho em quatro partes para 1) construímos uma cepa de levedura superexpressando heterodimers SNX-BAR para purificação de afinidade tandem, 2) expressar e purificar heterodimers nativos SNX-BAR, 3) preparar lipossomos sintéticos unilamellares, e 4) configurar uma tubulação liossoma ou ensaio sedimentações, fornecendo uma ferramenta vital para os pesquisadores para investigar o catálogo crescente de nexinos classificação encontradona natureza.

Protocol

1. Construção da tensão do fermento Comece com TVY614 (pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11 como a cepa pai. Esta cepa é deficiente para proteases vacuolares, que contribuem para a maioria da degradação da proteína após a lisose celular e, portanto, permite uma purificação mais limpa e eficiente. Projetar primers12 e integrar aplicação em conjunto purificação (TAP) tag no C-terminus de Atg20 (SNX-BAR ORF 1) u…

Representative Results

Este protocolo descreve um método para a produção reproduzível e robusta de complexos endógenos de levedura SNX-BAR que podem ser usados para ensaios de remodelação da membrana a jusante (Figura 1). A construção da cepa de levedura utilizada para purificação aproveita a eficiência da recombinação homóloga no fermento em brotamento, permitindo modificações nos loci genômicos dos SNX-BARs alvo (Figura 2). Este pro…

Discussion

Aqui, demonstramos um fluxo de trabalho otimizado para purificar os dimers SNX-BAR em levedura e dois ensaios para avaliar suas propriedades biofísicas em lipossomas sintéticos. A principal vantagem sobre a expressão típica de proteína recombinante em Escherichia coli ou outros sistemas é a capacidade de expressar uniformemente as proteínas SNX-BAR em um hospedeiro nativo, evitando assim as questões de toxicidade e insolubilidade encontradas na purificação de SNX-BARs em outros sistemas. Também é not…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de premiação GM060221 e em parte pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de prêmio T32GM007223. R.C. foi apoiado em parte pelo Programa de Bolsas de Pesquisa da Faculdade UNC-Charlotte.

Materials

0.2 micrometer PC Membranes Avanti 610006
10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) Bio-Rad 731-1550
27 Gauge needle BD Biosciences 301629
Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff Amicon UFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer Avestin EF-C3
BCA assay Pierce 23225
Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge Beckman Coulter 393315
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693116001
DOPC Avanti 850375
DOPS Avanti 840035
ergosterol (Sigma) Sigma 47130-U
Extruder Set with Block 0.2 microlter/1mL Avanti 610000
FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV)
Glass culture tubes VWR 47729-570
IgG sepharose beads (GE Healthcare) GE Healthcare 17-0969-01
Microlter glass syringes Hamilton 7637-01
New Brunswick Excella E25 Eppendorf M1353-0000 or equivalent shaking 30 C
Ni-NTA Magnetic Agarose Beads Pierce 78605
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94516
Parafilm M VWR 52858-076
PI3P Echelon P-3016 or Echelon equivalent
Polycarbonate bottle assembly Beckman Coulter 355622
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Type 45 Ti Rotor Beckman Coulter
Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve VWR 75871-436
Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) A&J Vacuum PN07050
Vortex with foam holder VWR 10153-838
VWR KIT MICROTUBE VWR 12620-880

References

  1. Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
  2. Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
  3. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
  4. Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
  5. Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
  6. Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
  7. van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
  8. Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
  9. Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
  10. Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
  11. Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  13. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  14. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  15. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
  16. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
  17. Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).

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Cite This Article
Ma, M., Goyal, S., Burd, C. G., Chi, R. J. Expression, Purification, and Liposome Binding of Budding Yeast SNX-BAR Heterodimers. J. Vis. Exp. (154), e60413, doi:10.3791/60413 (2019).

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