Выражение, очищение и липосома Связывание подающих надежды дрожжей SNX-BAR Heterodimers

Мембранные органеллы, такие как плазменная мембрана, эндоплазмический ретикулум, аппарат Голги, лизосомы (дрожжи вакуола) и эндосомы, составляют эндомембранную систему эукариотической клетки. Большинств органеллы имеют способность связывать и обменивать материал с другими organelles через переносится везикулы. Как ячейка координирует упаковку и формирование везикуловых транспортных носителей в рамках эндомембранной системы, не очень понятно. Тем не менее, белки и липиды, которые составляют большую часть эндомембранной системы, как известно, происходят из интернализации эндоцитарных пузырьков из плазменной мембраны (PM). Эндосомя является основной органелью приема для этих пузырьков и состоит из нескольких взаимосвязанных наборов трубчатых органелл. Основная функция эндосомы заключается в содействии приобретению питательных веществ, регулировать оборот белка и липидов, защищать от патогенной инфекции, а также служить основным источником пополнения липидов для плазменной мембраны. Поскольку эндосома получает основную часть грузовых белков и липидов из плазменной мембраны, она действует как сортировочный отсек, изолируя грузы в трубчатые эндосомальные транспортные носители (ETC). Любые белки, не секвестрированные в ETCs, остаются деградированными через эндо-лисосомную систему. Дисрегуляция сортировки грузов в ETCs может привести к потере поглощения питательных веществ, текучесть белка или липидного гомеостаза, что приводит к многочисленным метаболическим, развития и неврологическим расстройствам^1,2. Однако, несмотря на центральную роль ETCs в эндосоме, основной механизм того, как эндосома может выборочно координировать упаковку множества неоднородных грузов в трубчатые носители, неизвестен.

Сортировка nexin (SNX) семейство эволюционно сохраненный класс белков, которые были найдены, чтобы иметь решающее значение для многих реакций везикул транспорта в клетке^3,4,5. Сортировка нэксинов набираются в эндосомную мембрану и помогают в захвате груза через характерный фаркс-гомологический (PX) домен, который связывает фосфатидинозиноситол-3-монофосфат (PtdIns(3)P), липид, обогащенный на эндосомной мембране. Млекопитающие кодируют тридцать три белка SNX, которые могут быть дополнительно разделены на несколько подсемейств, в зависимости от наличия других доменов¹. Наиболее примечательно, что подсемейство SNX-BAR является крупнейшим подсемейством, состоящим из двенадцати человек, в то время как в подающих надежды дрожжах, Saccharomyces cerevisiae, подсемейство сводится всего до семи SNX-BARs. Белки SNX-BAR имеют как домен PX, так и домен Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR), который вызывает липидные резервуары для связывания положительных мембран кривизны. Следовательно, семья SNX-BAR имеет естественное сродство к эндосому и может посредничать образование ETC через их мембранные способности ремоделирования. В пробирке, ремоделирование свойства SNX-BARs может быть вызвано добавлением очищенных SNX-BARs к синтетическим липосомам и последующее образование узких, покрытых трубами могут быть визуализированы с помощью электронной микроскопии. Используя эти методы, исследователи определили, что как концентрация олигомеризации и прочность сужения, как представляется, различаются среди семьи SNX-BAR предполагая, что они могли бы помочь как в формировании и ножницы ETCs.

SNX-BARs могут быть дополнительно классифицированы по их эксклюзивным свойствам димеризации. В пробирке связывания анализы и структурные исследования показали, что SNX-BAR белки могут образовывать только конкретные homodimers или гетеродимы. Таким образом, в принципе, каждый потенциальный SNX-BAR димер-олигомер может обеспечить трубчатый слой для грузоперевозок, а также, ограниченная олигомеризация других протомеров SNX-BAR, может также определять различные пути экспорта. Однако, из-за большого количества SNX-BARs и разнообразия в семейство SNX, одна сортировка nexin-один грузовой гипотеза весьма маловероятно. Вместо этого более вероятно скоординированное усилие с использованием множества факторов, таких как SNX-BARs, груз, липидная специфичность и другие зависимости. Аналогичным образом, недавние исследования дрожжей семьи SNX4 показали доказательства для дополнительной липидной специфичности, за PtdIns (3)P, чтобы потенцировать эндосомы транспортных перевозчиков⁶. В этом исследовании, SNX-BAR гомодимер MVP1-MVP1 был очищен от бактерий и родной heterodimers Snx4-Atg20 и Vps5-Vps17 были выражены и очищены в высокой урожайности от дрожжей, в то время как только Snx4-Atg20 было установлено, что предпочтительно связывать фосфатидилсериин (PS) и узкая форма. В то время как другие в этой области выявили важные свойства SNX-BARs с использованием рекомбинантно очищенных SNX-BAR homodimers от бактерий, токсичность, связанная с выражением SNX-BAR гетеродимеров в аналогичных системах, препятствовала их родной характеристике^7,8,9,10. Поэтому, без надежной системы получения чисто рекомбинантно выраженных местных гетеродимеров, исследователи должны отойти от этих направлений исследования. На рисунке 1, мы представляем четыре части рабочего процесса до 1) построить штамм дрожжей overexpressing SNX-BAR гетеродимеров для тандема сродство очистки, 2) выразить и очистить родной SNX-BAR гетеродимеров, 3) подготовить unilamellar синтетические липосомы, и 4) создать липосомы трубуляции или осадок исследует, обеспечивая жизненно важный инструмент для исследователей, чтобы исследовать растущий каталог сортировки nexins найти в природе.