Expression, Reinigung und Liposomenbindung von angehenden Hefe-SNX-BAR-Heterodimeren

Membrangebundene Organellen wie die Plasmamembran, das endoplasmatische Retikulum, das Golgi-Gerät, Dassosom (Hefe-Vakuole) und endosom bilden das Endomembransystem der eukaryotischen Zelle. Die meisten Organellen haben die Fähigkeit, Material mit anderen Organellen durch Vesikeltransportträger zu kommunizieren und auszutauschen. Wie die Zelle die Verpackung und Bildung von Vesikeltransportträgern innerhalb des Endomembransystems koordiniert, ist nicht genau bekannt. Es ist jedoch bekannt, dass die Proteine und Lipide, die einen Großteil des Endomembransystems ausmachen, aus der Internalisierung endozytärer Vesikel aus der Plasmamembran (PM) stammen. Das Endosom ist die primäre Akzeptor-Organelle für diese Vesikel und besteht aus mehreren miteinander verbundenen Sätzen von röhrenförmigen Organellen. Die Hauptfunktion des Endosomes besteht darin, die Nährstofferfassung zu erleichtern, den Protein- und Lipidumsatz zu regulieren, vor Krankheitserregerinfektionen zu schützen und als primäre Wiederauffüllungsquelle für Lipide für die Plasmamembran zu dienen. Da das Endosom den Großteil der Ladungsproteine und Lipide aus der Plasmamembran erhält, fungiert es als Sortierraum, indem es Ladungen in röhrenförmige endosomale Transportträger (ETCs) isoliert. Alle Proteine, die nicht in ETCs sequestriert werden, müssen über das endolysosomale System abgebaut werden. Die Dysregulation der Ladungsortierung in ETCs kann zum Verlust der Nährstoffaufnahme, des Proteinumsatzes oder der Lipidhomöostase führen, was zu zahlreichen stoffwechsel-, Entwicklungs- und neurologischen^Störungen1^,2führt. Trotz der zentralen Rolle der ETCs beim Endosome ist jedoch der zugrunde liegende Mechanismus, wie das Endosom selektiv die Verpackung einer Vielzahl heterogener Ladungen in Röhrenträger koordinieren kann, nicht bekannt.

Die Sertiernexin-Familie (SNX) ist eine evolutionär konservierte Klasse von Proteinen, die für viele Vesikeltransportreaktionen in der Zelle^3,4,5kritisch sind. Sortiernvonnexine werden an die Endosome-Membran rekrutiert und helfen bei der Ladungsaufnahme über ihre charakteristische Phox-Homologie(PX)-Domäne, die Phosphatidylinositol-3-Monophosphat (PtdIns(3)P bindet, ein Lipid, das an der Endosome-Membran angereichert ist. Säugetiere kodieren 33 SNX-Proteine, die je nach Vorhandensein anderer^Domänenweiter in mehrere Unterfamilien unterteilt werden können. Vor allem die SNX-BAR-Unterfamilie ist die größte Unterfamilie, die aus zwölf menschlichen Unterfamilien besteht, während in der aufkeimenden Hefe Saccharomyces cerevisiaedie Unterfamilie auf nur sieben SNX-BARs reduziert wird. SNX-BAR-Proteine haben sowohl eine PX-Domäne als auch eine Bin-Amphiphysin-Rvs (BAR)-Domäne, die Lipidreservoirs auslöst, um positive Krümmungsmembranen zu binden. Folglich hat die SNX-BAR-Familie eine natürliche Affinität zum Endosom und kann die ETC-Bildung über ihre Membran-Remodellierungsfähigkeiten vermitteln. In vitro können die Remodellierungseigenschaften von SNX-BARs durch Zugabe von gereinigten SNX-BARs zu synthetischen Liposomen induziert werden und die anschließende Bildung schmaler, beschichteter Tubuli kann durch Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mit diesen Methoden haben die Forscher festgestellt, dass sowohl die Oligomerisierungskonzentration als auch die Verengungsfestigkeit in der SNX-BAR-Familie zu variieren scheinen, was darauf hindeutet, dass sie sowohl bei der Bildung als auch bei der Sission von ETCs helfen könnten.

Die SNX-BARs können weiter nach ihren exklusiven Dimerisierungseigenschaften klassifiziert werden. In-vitro-Bindungstests und Strukturstudien haben gezeigt, dass SNX-BAR-Proteine nur spezifische Homodimere oder Heterodimere bilden können. Daher könnte grundsätzlich jedes potentielle SNX-BAR Dimer-Oligomer einen Tubulenmantel für einen ladungsspezifischen Handelsweg liefern und ebenso kann die eingeschränkte Oligomerisierung der anderen SNX-BAR-Protomere auch unterschiedliche Exportwege definieren. Aufgrund der großen Anzahl von SNX-BARs und der Vielfalt innerhalb der SNX-Familie ist eine Einzige-Sortierung nexin-one-Frachthypothese jedoch höchst unwahrscheinlich. Stattdessen ist eine koordinierte Anstrengung mit einer Vielzahl von Faktoren wie SNX-BARs, Fracht, Lipidspezifität und anderen Abhängigkeiten wahrscheinlicher. Ebenso ergaben neuere Studien der Hefe-SNX4-Familie Hinweise auf zusätzliche Lipidspezifität, über PtdIns(3)P hinaus, um Endosome-Transportträger zu potenzieren⁶. In dieser Studie wurde SNX-BAR Homodimer Mvp1-Mvp1 von Bakterien gereinigt und native Heterodimere Snx4-Atg20 und Vps5-Vps17 wurden in hoher Ausbeute aus Hefe exprimiert und gereinigt, während nur Snx4-Atg20 gefunden wurde, um phosphatidylserin (PS) bevorzugt zu binden und in Liposomenbindungsstudien schmale röhrenartige Strukturen zu bilden⁶. Während andere auf diesem Gebiet wichtige Eigenschaften der SNX-BARs mit rekombinant gereinigten SNX-BAR-Homodimeren von Bakterien aufgedeckt haben, hat die Toxizität, die mit der Exzessierung von SNX-BAR-Heterodimeren in ähnlichen Systemen verbunden ist, ihre native Charakterisierung^7,8,9,10behindert. Daher müssen Forscher ohne ein zuverlässiges System, um rekombinant eduzierte native Heterodimere zu erhalten, auf diese Untersuchungslinien verzichten. In Abbildung 1präsentieren wir einen vierteiligen Workflow zu 1) konstruieren einen Hefestamm, der SNX-BAR-Heterodimere zur Tandemaffinitätsreinigung überexprimiert, 2) native SNX-BAR-Heterodimere ausdrücken und reinigen, 3) unilamellare synthetische Liposomen vorbereiten und 4) einen Liposomentubulations- oder Sedimentations-Assay einrichten, der ein wichtiges Werkzeug für Forscher darstellt, um den wachsenden Katalog von Nexinen zu untersuchen.