Expressie, zuivering en liposoom binding van ontluikende gist SNX-BAR Heterodimers

Aan het membraan gebonden organellen zoals het plasma membraan, het endoplasmatische reticulum, het Golgi-apparaat, lysosoom (gist vacuole) en endosome omvatten het endomembraansysteem-systeem van de eukaryote cel. De meeste organellen hebben de mogelijkheid om via blaasje transporteurs materiaal met andere organellen te communiceren en uit te wisselen. Hoe de cel de verpakking en de vorming van blaasje transport dragers binnen het endomembraansysteem-systeem coördineert, is niet goed begrepen. Echter, de eiwitten en lipiden die een groot deel van het endomembraansysteem-systeem vormen, zijn bekend dat ze afkomstig zijn van het internaliseren van endocytische blaasjes uit het plasma membraan (PM). De endosome is de primaire acceptor organel voor deze blaasjes en bestaat uit meerdere onderling verbonden sets van buisvormige organellen. De belangrijkste functie van de endosome is het vergemakkelijken van nutriënten verwerving, reguleren van de omzet van eiwitten en lipiden, beschermen tegen pathogenen infectie, en dienen als de primaire bijvullen bron van lipiden voor het plasma membraan. Omdat de endosome het grootste deel van de lading eiwitten en lipiden uit het plasma membraan ontvangt, fungeert het als een sorteer compartiment door cargo’s te isoleren in tubulaire endosomale transport dragers (ETCs). Alle eiwitten die niet in ETCs worden opgenomen, worden afgebroken via het Endo-lysosomale systeem. De disregulatie van de lading sortering in ETCS kan leiden tot het verlies van nutriëntenopname, eiwit omzet of lipide homeostase, resulterend in talrijke metabole, ontwikkelings-en neurologische aandoeningen^1,2. Ondanks de centrale rol van ETCs bij de endosome, is het onderliggende mechanisme van de manier waarop de endosome de verpakking van een veelheid van heterogene cargo’s selectief kunnen coördineren in buisvormige dragers, echter niet bekend.

Het sorteren van nexin (SNX) familie is een evolutionair gekonveerde klasse van eiwitten die zijn gebleken kritisch te zijn voor vele blaasje transport reacties in de cel^3,4,5. Het sorteren van nexins wordt gerekruteerd naar het endogeen membraan en hulp bij het opvangen van de lading via hun karakteristieke phox homologie (PX) domein, dat phosphatidylinositol-3-monofosfaat bindt (PtdIns (3) P), een lipide verrijkt op het endoeen membraan. Zoogdieren coderen 33 SNX-eiwitten, die verder kunnen worden onderverdeeld in meerdere subfamilies, afhankelijk van de aanwezigheid van andere domeinen¹. Met name de SNX-BAR subfamilie is de grootste onderfamilie bestaande uit twaalf mensen, terwijl in ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae, de onderfamilie wordt gereduceerd tot slechts zeven SNX-BARs. SNX-BAR eiwitten hebben zowel een PX domein als een bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domein dat lipide reservoirs activeert om positieve kromming membranen te binden. Bijgevolg heeft de SNX-BAR familie een natuurlijke affiniteit voor de endosome en kan ze de vorming van ETC bemedieren via hun membraan remodellering capaciteiten. In vitro kunnen de verbouwingen van SNX-BARs worden geïnduceerd door de toevoeging van gezuiverde SNX-staven aan synthetische liposomen en de daaropvolgende vorming van smalle, gecoate tubuli kan worden gevisualiseerd door elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methoden, onderzoekers hebben vastgesteld dat beide oligomerisatie concentratie en vernauwing sterkte lijken te variëren tussen de SNX-Bar familie suggereren dat ze konden helpen in zowel de vorming en de scissie van ETCS.

De SNX-BARs kunnen verder worden geclassificeerd door hun exclusieve door dimerisatie-eigenschappen. In vitro binding testen en structurele studies hebben aangetoond dat SNX-BAR eiwitten alleen specifieke homodimers of heterodimers kunnen vormen. Daarom, in principe, elke potentiële SNX-BAR dimer-oligomeren zou kunnen bieden een tubulus Coat voor een Cargo-specifieke handel traject en ook, de beperkte oligomerisatie van de andere SNX-BAR protomers, kunnen definiëren verschillende export trajecten. Echter, vanwege het grote aantal SNX-BARs en diversiteit binnen de SNX-familie, is een één Sorteer nexin-One Cargo hypothese hoogst onwaarschijnlijk. In plaats daarvan een gecoördineerde inspanning met behulp van een veelheid van factoren, zoals SNX-BARs, lading, lipide specificiteit en andere afhankelijkheden is waarschijnlijker. Evenzo, recente studies van de gist SNX4 familie geopenbaard bewijs voor extra lipide specificiteit, buiten PtdIns (3) P, te versterken endosome transport dragers⁶. In deze studie, SNX-Bar homodimer Mvp1-Mvp1 werd gezuiverd van bacteriën en inheemse heterodimers Snx4-Atg20 en Vps5-Vps17 werden uitgedrukt en gezuiverd in hoge opbrengst van gist, terwijl alleen Snx4-Atg20 werd gevonden om bij voorkeur binden fosfatidylserine (PS) en vormen smalle buis-achtige structuren in liposoom bindende studies⁶. Terwijl anderen in het veld hebben onthuld belangrijke eigenschappen van de SNX-BARs met behulp van recombinantly gezuiverde SNX-Bar homodimers van bacteriën, toxiciteit in verband met uitdrukken SNX-Bar heterodimers in vergelijkbare systemen hebben hun inheemse karakterisering^7,8,9,10belemmerd. Daarom, zonder een betrouwbaar systeem te verkrijgen zuivere recombinantly uitgedrukt inheemse heterodimers, onderzoekers moeten afzien van deze onderzoekslijnen. In Figuur 1presenteren we een vierdelige workflow aan 1) om een gist-stam te maken die de SNX-Bar heterodimers overdrukt voor het zuiveren van tandem-affiniteit, 2) Express en zuiveren inheemse SNX-Bar heterodimers, 3) bereid unilamellaire synthetische liposomen, en 4) opzetten van een liposoom tubulatie of sedimentaties Assay, het verstrekken van een essentieel instrument voor onderzoekers om de groeiende catalogus van het sorteren nexins gevonden in de natuur te onderzoeken.