우리는 뮤린 근세포를 분리하는 방법론과 동시 디지털 세포 기하학 측정을 통해 형광 광도계를 사용하여 sarcomere 단축 추적과 동시에 전압 또는 칼슘 흔적을 얻는 방법을 제시합니다.
성인 심장 근세포를 분리하는 능력은 연구원이 단 하나 세포 수준에 있는 심장 병리학의 다양한 공부하는 것을 허용했습니다. 칼슘 에민감한 염료의 발전은 단일 세포 칼슘 역학의 강력한 광학 기록을 허용했지만, 강력한 막간 광 전압 신호의 기록은 여전히 어려웠습니다. 틀림없이, 이것은 낮은 단일 대 소음 비율, 광 독성 및 전통적인 전위 성 염료의 광 표백 때문입니다. 따라서 단일 셀 전압 측정은 오랫동안 패치 클램프 기술에 국한되어 왔으며, 이는 금 본위제이지만 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮습니다. 그러나 새로운 전위성 염료의 개발로, 전압 변화에 대한 크고 빠른 광학 반응은 광독성 및 광표백과 거의 또는 전혀 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 단축, 칼슘 및 광학 전압 측정에 사용할 수 있는 성인 뮤린 근세포를 분리하는 방법을 자세히 설명합니다. 구체적으로, 프로토콜은 비율측정 칼슘 염료, 단일 여기 칼슘 염료 및 단일 여기 전압 염료를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 다양한 화학 약제의 심장 독성 및 부정맥성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 광독성은 여전히 단일 세포 수준에서 문제가되지만 방법론은 이를 줄이는 방법에 대해 논의됩니다.
건강하고 병리학적인 상태 동안 심장을 연구하기 위해서는 단일 세포 수준에서 표현형을 검사하는 것이 종종 유용합니다. 과학적 진보로 단일 세포 칼슘 역학의 강력한 측정이 허용되었지만 단일 셀 광학 전압 측정은1에거의 남아 있습니다. 틀림없이, 이것은 낮은 신호 대 잡음 비 (SNR), 광 독성 및 전통적인 전위 염료2,3의광 표백 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 단리된 근세포 광학 작용 전위는2,3,4. 또한, 화학 및 전압 에민감한 염료의 물리학의 발전과 함께, SNR은5를향상시켰다. 새로운 멤브레인 전위프로브(표)는밀리초 단위로 멤브레인 전위 변화에 반응하며 100 mV당 약 25%의 형광 반응 범위를 갖습니다. 또한, 멤브레인 전위 키트의 여기/방출(예를 들어, FluoVolt; 재료 표) 이 프로토콜에서 사용되는 표준 플루오레세인 이소티오시오야네이트(FITC) 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 설정6.
FITC 및 GFP 여기/방출 스펙트럼은 플루오-4 칼슘 경계 스펙트럼7과겹칩니다. 디지털 세포 기하학 측정과 형광 광도계의 동시 수집은 전통적으로 칼슘 및 세포 단축 측정의 동시 수집에 사용되어 왔다8. 이 프로토콜은 뮤린 근세포분리 방법과 표준 FITC 설정을 사용하여 칼슘 또는 전압 신호를 기록하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이미징 워크스테이션의 여기/방출 필터의 간단한 스위치를 사용하여 비율 메트릭 메트릭 칼슘 염료 fura-2를 사용하여 칼슘 및 단축 측정을 얻을 수 있는 방법을 설명합니다. 플루오-4에 비해 fura-2는 칼슘에 대한 친화력이 높으며 광표백9에상대적으로 내성이 있습니다. 따라서 단일 워크스테이션을 사용하여 이 프로토콜을 사용하면 단독으로 근세포 여기-수축 커플링을 철저히 검사할 수 있습니다.
심장 근세포를 분리할 수 있다는 것은 심장 생리학, 병리학 및 독성학을 이해하는 데 사용할 수 있는 강력한 방법입니다. 상기 프로토콜에서, 우리는 단일 심장 근세포를 얻기 위해 일정한 중력 압력 Langendorff 장치를 활용하는 방법을 설명했다. 그 후 형광측정 시스템을 사용하여 칼슘과 단축 또는 전압을 동시에 획득하고 트레이스를 단축하는 방법을 설명합니다.
칼슘 염료 사이의 역학이 다르기 때문에 어떤 염료를 선택해야 할지 주의해야 합니다. 이 프로토콜을 위해, 사용된 fura-2 와 플루오-4 둘 다 AM 에스테르로 설계되어 세포내 에스테르가 AM 군을 절단하고 세포에 염료를 가두는 시간을 허용하기 위해 세척 단계를 필요로 했다. 후라-2와 플루오-4 둘 다 높은 친화도 칼슘 염료로 간주되지만, fura-2에 대한 Kd는 플루오-49에대한 345 nM에 비해 145 nM이다. 또한, 후라-2는 비메트릭이다. 이 때문에 세포내 칼슘 수치를9,12로정량화하는데 사용할 수 있다. 한편 플루오-4는 단일파 칼슘 프로브이다. fluo-4를 사용하면 더 밝은 형광 신호를 생성할 수 있다는 장점이 있습니다. 칼슘 염료가 사용되는 칼슘 염료에 관계없이, 칼슘 염료에 비해, 멤브레인 전압 프로브는 낮은 SNR을 갖는다.
그림 4 및 그림 5에나타난 바와 같이, 칼슘 트레이스와 비교한 전압 트레이스는 진폭이 더 작다. 소프트웨어의 디지털 추적 필터링을 사용하여 SNR을 증가시키고 데이터를 정량화할 수있습니다(그림 4 및 그림 7). 일단 정량화되면, 칼슘 과도 및 광학 APD는 빠른 속도 주파수에서 그들의 기간을 단축, 복원을 보여줍니다(그림 2, 그림 3, 그림 6,및 그림 7). 빠른 속도 주기 동안 더 짧은 APD는 확장기 도중 심실 충진을 위한 충분한 시간을 허용하기 위하여 필요합니다. 이 현상의 변화는13,14,15,16의위험증가를 나타내는 것으로 생각된다. APD에 있는 변경은 질병에 기인할 수 있는 동안, 또한 화학제품에 기인할 수 있습니다. 도 7에도시된 바와 같이, 우세한 뮤린 이극화 칼륨 전류가, Ito는차단되고, 광학 APD는 더 길어진다.
여전히, 전압 에민감한 염료와 함께 이전에보고 된 바와 같이, 빛의 강도와 기간은 APD2,5,17을변경할 수 있습니다 . 이는 반응성 산화종(ROS)의 생성의 결과로 여겨진다5. 이전에는 기록 용액에 항산화제를 첨가하면 전압에 민감한 염료 세포 독성을 방지할 수 있는 것으로 나타났습니다5. 그 결과, 티로드의 용액에 항산화 L-글루타티온(10 mM)을 첨가했습니다. 그림 8에 도시된 것은 1Hz 속도에서 얻은 20s 레코딩의 마지막 11s입니다. 빨간색 화살표로 표시된 대로 APD의 변경은 15s까지 기록으로 발생하지 않았습니다. 따라서, 수정 된 Tyrode의 솔루션은 광독성을 방지하지 않았지만 크게 지연. 수정된 Tyrode 의 용액을 사용하여 낮은 조명 강도 설정을 사용하고 기록 지속 시간을 5s 미만으로 유지하면 APD에서 염료로 인한 변경을 방지할 수 있습니다. 이는 광독성을 피하기 위해 주의를 기울이지 않으면 데이터가 탈분극 후 조기 또는 지연을 유발하는 것으로 잘못 해석될 수 있기 때문에 중요합니다. 청색광에 대한 노출을 제한하는 것 외에도 데이터의 잘못된 해석을 방지하기 위해 취할 수 있는 추가적인 예방 조치가 있습니다.
첫 번째는 1~1개의 간격을 따르는 세포에서만 기록하고 1.75 μm보다 크거나 같은 나머지 사르카망 길이를 가지고 있는 것입니다. 1.75 μm 컷오프는 고든 외18에 의해 관찰에서 취해져 서사커 길이가 이 양 이하이되면 긴장이 급격히 감소합니다. 그럼에도 불구 하 고, 특정 병 리 휴식 sarcomere 길이에 상당한 변경 귀 착될 수 있습니다. 표현형이 실재하고 격리의 아티팩트가 아니라는 것을 확인하려면 다음과 같은 문제 해결 방법을 취해야 합니다.
근세포가 지속적으로 1:1 간격을 따르지 않거나, 1.75 μm 이하의 사르코메르 길이를 가지거나, 무거운 막 이블빙을 하거나, 격리에서 살아남지 못하는 경우, 가장 먼저 확인하는 것은 심장을 수분화하는 데 걸린 시간입니다. 캐넨화 시간이 길수록 수율이 낮아집니다. 긴 통조림 시간이 필요한 경우 심장을 심전도용액(19)에배치하여 생존력을 향상시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 콜라게나제는 효소이기 때문에, 특정 로트의 활성 및 특이성은 시간이 지남에 따라 변화한다. 전체 수익률이 양호한 시기에도 불구하고 점진적으로 악화되면 새로운 로트를 분석해야 합니다. 당사의 프로토콜은 5초 의 기록에 최적화되었지만 더 긴 전압 추적이 필요한 경우 추가 중성 밀도 필터를 구입해야 합니다. 프로토콜에 설명된 시스템은 투과된 빛을 37%, 50%, 75%, 90%, 95%까지 줄이는 중립 밀도 필터와 함께 제공됩니다.
요약하면, 우리는 칼슘, 전압 및 sarcomere 단축 측정에 사용된 성인 뮤린 심실 근세포의 격리를 허용하는 방법론을 기술했습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고의 주의 깊은 교정에 대한 다나 모르겐스테른에게 감사드립니다.
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
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Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
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Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |