Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

Toutes les méthodes et procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Case Western Reserve. 1. Préparation de solutions, d’instruments et de fiches de couverture REMARQUE : Les solutions 1x peuvent être utilisées jusqu’à un mois. Faire 10x Krebs-Henseleit tampon HEPES tampon sans calcium (KHB-HB) en ajoutant 68,96 g de NaCl, 3,57 g de KCl, 59,58 g de HEPES, 2,18 g de K2HPO4, 3,08 g de MgSO4 et 19,82 g de glucose à 800 ml d’eau distillée double dans un flacon de 1 000 ml. Une fois le contenu complètement dissous, porter jusqu’au volume dans un flacon volumétrique de 1 000 ml.REMARQUE : La solution traditionnelle Krebs Henseleit utilise le bicarbonate de sodium comme tampon et la solution dans ce protocole utilise la solution Krebs Henseleit avec tampon HEPES. La solution est stable pendant 6 mois si stérilefiltrée. Faire la solution de 10x Tyrode en ajoutant 86,51 g de NaCl, 0,552 g de NaH2PO4, 2,03 g de MgCl2, 9,91 g de glucose, 4,03 g de KCl, 2,65 g de CaCl2, et 35,76 g de HEPES à 800 ml d’eau distillée double dans un flacon de 1000 ml. Une fois le contenu complètement dissous, porter jusqu’au volume dans un flacon volumétrique de 1000 ml.REMARQUE : La solution est stable pendant 6 mois si stérilefiltrée. Faire 1x KHB-HB en mesurant 100 ml du stock 10x et en ajoutant à 875 ml d’eau double distillée dans un flacon de 1 000 ml. Placer le flacon dans un bain d’eau de 37 oC. Une fois que la solution a atteint 37 oC, utilisez NaOH pour augmenter le pH à 7,39. Après ajustement du pH, apportez la solution au volume dans un flacon volumétrique de 1000 ml. Filtre stérile la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Faire 1x Tyrode solution en mesurant 100 ml du stock 10x et en ajoutant à 875 ml d’eau double distillée dans un flacon de 1000 ml. Placer le flacon dans un bain d’eau de 37 oC. Une fois que la solution a atteint 37 oC, utilisez NaOH pour augmenter le pH à 7,39. Après ajustement du pH, apportez la solution au volume dans un flacon volumétrique de 1 000 ml. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtration sous vide. Faire 1x modifié la solution de Tyrode en mesurant 100 ml du stock 10x et en ajoutant à 875 ml d’eau double distillée dans un flacon de 1 000 ml. Dissoudre 3,07 g de L-glutathion réduit en flacon. Placer le flacon dans un bain d’eau de 37 oC. Une fois que la solution a atteint 37 oC, utilisez NaOH pour augmenter le pH à 7,39. Après ajustement du pH, apportez la solution au volume dans un flacon volumétrique de 1 000 ml. Filtre stérile la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Faire 100 mM de blebbistatin solution de stock en ajoutant 855 L de sulfoxide de diméthyle (DMSO) à 25 mg de poudre. Aliquot sorti par incréments de 20 L et conserver dans un congélateur de -80 oC jusqu’à six mois. Faire l’arrêt tampon en ajoutant 2 g d’albumine de sérum bovin (BSA) et 1 flacon de stock de blebbistatin aliquoted à 100 ml de 1x KHB-HB et filtre stérile la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Faire tampon de placage en ajoutant 5 ml de sérum bovin fœtal et 1 flacon du stock de blebbistatin aliquoted à 95 ml de M199 HEPES. Filtre stérile la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Faire tampon de culture de myocyte en ajoutant un 1 flacon du stock de blebbistatin aliquoted et 4 mls pénicilline-streptomycine à 396 ml de M199 (25 mM HEPES). Filtre stérile la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide. Autoclave 2 paires de pinces Dumont, 2 paires de ciseaux incurvés Iris, 2 hemostats, une paire de forceps de chirurgie plastique, 6 sutures noires tressées en soie 4-0 disposées pour être utilisées comme noeud chirurgical à double jet, et quatre béchers de 100 ml. Stériliser les couvercles en verre de 22 x 22 mm2. Tout d’abord, placez un seul bordereau dans chaque puits d’une plaque de six puits. Ensuite, avec le couvercle enlevé, allumez la lampe UV de l’armoire de biosécurité et exposez les couvercles à la lumière UV pendant 1 h. Faire la solution de bouillon de lamininde de travail en dégelant d’abord la bouteille sur la glace. Ajoutez le contenu d’une bouteille à suffisamment de saline stérile à phosphate froide (PBS) pour atteindre une concentration finale de 0,04 mg/mL. Aliquot sorti 1,3 L dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL autoclaved. Conserver à -80 oC.REMARQUE: Chaque tube a assez de lamininin pour une seule plaque de six puits. Évitez les cycles de dégel multiples. Enrober la couverture stérilisée en dégelant d’abord la solution de laminine de travail sur la glace. À l’aide d’une pipette P1000, aspirez 200 l de laminin. Faites glisser doucement la pointe de la pipette le long d’un bord de la glissière de couverture pour permettre à l’action capillaire de retirer une minuscule quantité de lamininin pour faciliter l’attachement de la feuille de couverture à la plaque de six puits. Ensuite, expulsez le laminin restant au centre de la couverture. Dans un mouvement circulaire, étaler la gouttelette de laminin sur la feuille de couverture. Placer dans un incubateur de 37 oC au moins 1 h et jusqu’à 24 h avant l’isolement. 2. Préparation de l’Apparatus Langendorff REMARQUE : Les composants individuels de l’appareil Langendorff utilisés dans ce protocole sont énumérés dans le Tableau des matériaux. Allumez le bain d’eau en circulation. Définir la température de sorte que le perfusate ait une température de 37 oC.REMARQUE : Une fois les réservoirs de solution réglés à une hauteur de 60 cm, la nappe phréacine en circulation doit être fixée à 41 oC pour que le perfusat e soit de 37 oC. Contrairement aux protocoles précédemment signalés, la hauteur du réservoir n’a pas besoin d’être modifiée. Rincer l’appareil Langendorff avec 70% d’éthanol suivi de deux rinçants avec de l’eau double distillée autoclave. Après le rinçant, remplissez le réservoir de KHB-HB et oxygénez avec 100% d’oxygène. Primer le système en permettant à KHB-HB oxygéné de s’écouler d’abord dans un bécher de 100 ml. Une fois que 50 ml de solution s’est déversé dans le bécher, changez la position à trois voies du stop-cock pour arrêter le débit du réservoir KHB-HB. Verser 50 ml de KHB-HB oxygéné du bécher dans le réservoir de collagène. Laissez le KHB-HB s’écouler du réservoir de digestion jusqu’à ce que 5 mL reste dans le réservoir de collagène. Pendant l’amorçage du réservoir de collagène, changez le coq d’arrêt à 3 voies à plusieurs reprises entre les réservoirs pour permettre aux lignes de se dégazer. Une fois le système amorcé, n’oubliez pas d’utiliser le piège de dégazage situé au-dessus de la bobine chauffante pour permettre à tout air restant de sortir du système. Faire la solution de collagène. Pour les rats combinent 100 mg de collagène de type II, 100 ml de KHB-HB oxygéné et 2 flacons du stock de blebbistain. Pour les souris, mélanger 100 mg de collagène de type II, 40 ml de KHB-HB oxygéné et 2 flacons du stock de blebbistain. Une fois mélangée, la solution doit être stable pendant 1 h.REMARQUE : La viabilité du myocyte peut varier entre les lots de collagène de type II. Profitez d’un programme d’échantillonnage de collagène pour tester beaucoup avant de commander en vrac. 3. Isolement de Myocyte Injecter à l’animal 1 000 U d’héparine. Attendez 5 min.REMARQUE : Les souris et les rats de tout âge peuvent être utilisés. Cependant, en général, plus l’animal est âgé ou plus malade, plus le myocyte est faible. Sacrifiez l’animal en l’anesthésiant d’abord avec de l’isoflurane à l’aide de la méthode à goutte ouverte (1 cc d’Isoflurane pour un volume de 500 cm3) avant d’euthanasier l’animal avec un mélange de pentobarbital (150 mg/kg intrapéritone). Excisez rapidement le cœur en saisissant d’abord la fourrure au-dessus du processus xiphoïde. Avec les ciseaux d’iris, faire une petite incision immédiatement au-dessous du processus de xiphoïde et tirer la fourrure vers le haut vers la tête exposant la peau. Prenez le processus de xiphoïde et coupez le diaphragme exposant la cavité thoracique. Faire une incision de porte de piège, tirer le sternum en arrière à l’aide d’un hemostat, et utiliser les forceps incurvés pour exciser le cœur au-dessus de l’aorte ascendante et placer dans le froid KHB-HB. Cannulelement du cœur à l’aide d’un microscope stéréo et de forceps numéro 5. Assurez-vous que le cœur est submergé et la canule a été amorcée avant l’excision cardiaque pour prévenir les embolies. Confirmer le bon positionnement de la canule en visualisant la pointe de la canule à environ 1 mm au-dessus de l’insertion aortique dans le ventricule.REMARQUE : Plus le temps de cannulation est rapide, meilleur est le rendement du myocyte. Démarrer le flux de KHB-HB en tournant le stopcock sur le Langendorff. Connectez la canule au Langendorff. Persévisser le cœur pendant 5 min.REMARQUE : Puisque la perfusion est fournie par un système basé sur la gravité, le flux par le coeur sera une fonction de la conformité d’artère coronaire. Passez la perfusion du réservoir KHB-HB au réservoir tampon de digestion. Une fois que le tampon de digestion atteint le cœur, définir une minuterie (5 min pour la souris ou 15 min pour le rat). Assurez-vous de recueillir le perfusate dans un bécher stérile de 100 ml. Remplissez le réservoir tampon de digestion au besoin avec le perfusate jusqu’à ce que le temps de digestion ait expiré. Après la digestion, séparer les chambres du cœur avec des forceps et les ciseaux d’iris dans un bécher stérile de 100 ml. Placer chaque chambre dans un puits séparé d’une plaque de six puits. Verser 5 ml de solution de collagène dans chaque puits. Immédiatement commencer à hacher le tissu cardiaque à l’aide de ciseaux. Les morceaux de tissu doivent être d’environ 1 mm3. À l’aide de pipettes de transfert stériles, trituratez délicatement le tissu cardiaque haché. La solution devrait devenir trouble. Une fois que les morceaux de tissu deviennent blancs et plumeux, examinez les cellules à l’aide d’un microscope inversé. Si le nombre de cellules viables est supérieur à 80 %, procédez à la tension entre les cellules dans un tube conique de 50 ml à l’aide d’une passoire cellulaire de 100 m. Utilisez un tube et une passoire différents pour chaque chambre du cœur. Si le nombre de cellules viables est inférieur à 80%, vérifiez le temps qu’il a fallu pour cannuler. Si le temps de cannulation est plus de 5 min, essayez un autre coeur. Si ce n’est pas le cas, aspirez à de nouveaux lots de collagène dans le cadre du programme d’échantillonnage de collagène. Pelleter les cellules en centrifugeant à 215 x g pendant 2 min. Le granule doit être compact et ne pas lâcher. Si le granule est lâche, la préparation contient de nombreuses cellules mortes. Dans une hotte de culture tissulaire, resuspendre la pastille en 10 ml de tampon d’arrêt. Pelleter les cellules en centrifugeant à 215 x g pendant 2 min. Le granule doit être compact et ne pas lâcher. Si le granule est lâche, la préparation contient de nombreuses cellules mortes. Resuspendre les cellules dans 5 ml de tampon de placage. Effectuez un comptage cellulaire. Ajuster les millilitres de tampon de placage pour atteindre une concentration finale de myocytes de 2 x 104 cellules par mL. Retirer les couvercles recouverts de laminin de l’incubateur. Aspirez la gouttelette de laminin. Plaque de 200 l de suspension de myocyte sur chaque bordereau. Placer dans un incubateur de 37 oC (21 % O2, 5 % CO2) pendant 2 h pour permettre l’attachement. Après 2 h, aspirer les cellules non attachées, ajouter 2 mL de médias de culture, et la culture pour un jusqu’à 4 jours. 4. Chargement de teinture Fura-2 Faire une solution de stock de 2 mM de fura-2 en acéoxyméthyle (fura-2 AM) en ajoutant 25 L de DMSO à 50 g de poudre de fura-2 AM (1 flacon). Aliquot en 6 aliquots L. Prendre 1 aliquot de fura-2 AM et ajouter à 6 ml de milieu de placage. Vortex à mélanger. Retirer 1 six plaques de myocytes de puits de l’incubateur. Aspirez les médias. Ajouter 1 ml de mélange de mélange de temps fura-2 à chaque puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium, laisser la plaque à température ambiante et attendre 15 min. Aspirez le mélange de médias fura-2 et ajoutez 1 ml de la solution de Tyrode à chaque puits. Couvrir de papier d’aluminium. Attendre 20 min à température ambiante pour permettre le lavage des teintures avant l’imagerie. 5. Chargement de teinture Fluo-4 Faire une solution de stock de 1,82 mM de fluo-4 acétoxithyle (fluo-4 AM) en ajoutant 25 L de DMSO à 50 g de poudre de fluo-4 AM (1 flacon). Aliquot en 8.333 aliquots L. Prendre 1 aliquot de bouillon fluo-4 AM et ajouter à 6 ml de milieu de placage. Vortex à mélanger. Retirer 1 six plaques de myocytes de puits de l’incubateur. Aspirez les médias. Ajouter 1 ml de mélange de fluo-4 AM à chaque puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium, laisser la plaque à température ambiante et attendre 15 min. Aspirez le mélange de médias fluo-4 AM et ajoutez 1 ml de la solution de Tyrode à chaque puits. Couvrir de papier d’aluminium. Attendre 20 min à température ambiante pour permettre le lavage des teintures avant l’imagerie. 6. Chargement potentiel de teinture de membrane Retirez le composant A et le composant B du kit potentiel de membrane. Dans un tube conique de 15 ml, mélanger 50 l de composant B et 5 l de composant A. Vortex pour mélanger. Ajouter 10 ml de support de placage au tube conique de 15 ml contenant le mélange de colorant de tension. Vortex à mélanger. Retirer 1 six plaques de myocytes de puits de l’incubateur. Aspirez les médias. Ajouter 800 l l du mélange de colorant potentiel de membrane à chaque puits. Couvrir la plaque de papier d’aluminium, laisser la plaque à température ambiante et attendre 15 min. Aspirez le mélange de médias de colorant et ajoutez 1 ml de la solution modifiée-Tyrode à chaque puits. Couvrir de papier d’aluminium. 7. Photométrie et charge d’enregistrements couplés d’appareils Allumez l’équipement dans l’ordre suivant : microscope, lampe d’arc, hyperswitch, système d’interface de fluorescence, alimentation myocam, stimulateur de champ, et ordinateur. Assurez-vous que les ensembles de filtres d’excitation/émission sont appropriés pour le colorant d’imagerie.REMARQUE: Fura-2 est excité à 340 nm et 380 nm de lumière. Il émet à 510 nm de lumière. Fluo-4 et le colorant de membrane de tension sont excités à 485 nm de lumière et émettent à 520 nm de lumière. Primer le système en allumant le vide, en ouvrant complètement la pince du tuyau et en plongeant doucement chaque seringue de 60 ml utilisée dans le collecteur. Pour les enregistrements de calcium, utilisez la solution de Tyrode. Pour les enregistrements de tension, utilisez la solution modifiée de Tyrode. Allumez le chauffe-eau et réglez le débit en ajustant la pince à rouleaux sur le tube de perfusion. Faites des enregistrements à 36 ‘1 ‘C. Ouvrez le logiciel d’acquisition. Assurez-vous que les paramètres sont réglés pour le colorant d’imagerie correct. Dans l’obscurité, retirer le papier d’aluminium de la plaque de six puits et placer un bordereau dans la chambre de stimulation. Assurez-vous que le stimulateur est éteint pendant cette étape. Concentrez-vous sur les myocytes en utilisant l’objectif 10x. Une fois au point, commencez à arpenter en stimulant le champ à 1 Hz, 0.2 V. Augmentez graduellement la tension jusqu’à ce que 1:1 rythme est obtenu. Ensuite, augmentez la tension jusqu’à 1,5x le seuil est atteint.REMARQUE : Étant donné que le couplage excitation-contraction dépend de la température, assurez-vous que les cellules ont été perflées pendant 15 minutes avant l’enregistrement. Cela permet aux myocytes de se remettre du choc de la température ambiante à 37 oC ainsi que des cellules lâchement attachées pour flotter. Passer de l’objectif 10x à l’objectif 40x. Concentrez-vous sur une cellule qui suit un rythme 1:1. Ajustez les nuances en plastique de sorte qu’une seule cellule est dans le champ de vision. À l’aide du logiciel, placez la zone d’intérêt sur des sarcoques bien définis. Démarrer le logiciel d’acquisition pour initier la lumière d’excitation. À l’aide des filtres à densité neutre, ajustez le réglage de l’intensité en conséquence pour obtenir un SNR adéquat.