Imagem óptica de miócitos ventriculares isolados de urina

Todos os métodos e procedimentos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Case Western Reserve University. 1. Preparação de Soluções, Instrumentos e Coverslips NOTA: As soluções 1x podem ser usadas por até um mês. Faça 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer sem cálcio (KHB-HB), adicionando 68,96 g de NaCl, 3,57 g de KCl, 59,58 g de HEPES, 2,18 g de K2HPO4, 3,08 g de MgSO4 e 19,82 g de glicose para 800 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Depois que o conteúdo estiver totalmente dissolvido, traga até o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL.NOTA: A solução tradicional Krebs Henseleit usa bicarbonato de sódio como um amortecedor e a solução neste protocolo usa a solução Krebs Henseleit com tampão HEPES. A solução é estável por 6 meses se estéril filtrada. Faça a solução de 10x Tyrode adicionando 86,51 g de NaCl, 0,552 g de NaH2PO4, 2,03 g de MgCl2, 9,91 g de glicose, 4,03 g de KCl, 2,65 g de CaCl2, e 35,76 g de HEPES para 800 mL de água destilada dupla em um frasco de 1000 mL. Depois que o conteúdo estiver totalmente dissolvido, traga até o volume em um frasco volumétrico de 1000 mL.NOTA: A solução é estável por 6 meses se estéril filtrada. Faça 1x KHB-HB medindo para fora 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL da água destilada dobro em uma garrafa de 1.000 mL. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1000 mL. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo. Faça a solução de 1x Tyrode medindo 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL. Filtro estéril usando um sistema de filtragem de vácuo. Faça a solução do Tyrode modificado 1x medindo 100 mL do estoque de 10x e adicionando a 875 mL de água destilada dupla em um frasco de 1.000 mL. Dissolva 3,07 g de L-glutationa reduzida em frasco. Coloque o frasco em 37 °C banho de água. Uma vez que a solução atingiu 37 °C, use o NaOH para aumentar o pH para 7,39. Depois de ajustar o pH, traga a solução para o volume em um frasco volumétrico de 1.000 mL. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo. Faça 100 mM blebbistatin solução de ações, adicionando 855 μL de dimetil sulfoxide (DMSO) para 25 mg de pó. Aliquot em incrementos de 20 μL e armazenar em um freezer -80 °C por até seis meses. Faça a parada tampão adicionando 2 g de albumina de soro bovina (BSA) e 1 frasco de estoque de blebbistatin aliquoted para 100 mL de 1x KHB-HB e filtro estéril a solução usando um sistema de filtragem de vácuo. Faça o amortecedor do revestimento adicionando 5 mL do soro bovino fetal e 1 frasco do estoque alicitado do blebbistatin a 95 mL de M199 HEPES. Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo. Faça a cultura miócito tampão adicionando um frasco 1 do estoque alicitado do blebbistatin e 4 mls penicilin-streptomycin a 396 mL de M199 (25 mM HEPES). Estéril filtrar a solução usando um sistema de filtragem de vácuo. Autoclave 2 pares de pinças Dumont, 2 pares de tesouras curvas iris, 2 hemostats, um par de fórceps de cirurgia plástica, 6 suturas de seda trançada preta 4-0 dispostas a serem usadas como um nó cirúrgico de arremesso duplo e quatro taças de 100 mL. Esterilizar 22 x 22 mm2 cobres de vidro. Primeiro, coloque um único coverslip em cada poço de uma placa de seis poços. Depois, com a tampa removida, ligue a lâmpada UV do armário de biossegurança e exponha os lábios à luz UV por 1 h. Faça a solução de estoque de lamina de trabalho primeiro descongelando a garrafa no gelo. Adicione o conteúdo de uma garrafa para suficiente frio estéril fosfato tampão sisino (PBS) para atingir uma concentração final de 0,04 mg / mL. Aliquot para fora 1.3 μL em tubos autoclaved da centrífuga de 1.5 mL. Armazenar a -80 °C.NOTA: Cada tubo tem laminado suficiente para uma única placa de seis poços. Evite vários ciclos de degelo de congelamento. Revestimento esterilizado coverslip primeiramente descongelando a solução de funcionamento da estratificação no gelo. Usando uma pipeta P1000, aspirar 200 μL de laminina. Arraste delicadamente a ponta da pipeta ao longo de uma borda do coverslip para permitir que a ação capilar retire uma quantidade minúscula de estratificação para facilitar o acessório do coverslip à placa de seis poços. Em seguida, expulsar a laminado restante no centro do deslizamento de capa. Em um movimento circular, espalhe a gota de laminado através do coverslip. Coloque em uma incubadora de 37 °C pelo menos 1 h e até 24 h antes do isolamento. 2. Preparação do Aparato langendorff NOTA: Os componentes individuais do aparelho Langendorff utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Ligue o banho de água circulante. Estabeleça a temperatura de modo que o perfusate tenha uma temperatura de 37 °C.NOTA: Com os reservatórios da solução ajustados a uma altura de 60 cm, o waterbirth circulante precisa de ser ajustado a 41 °C para mandar o perfusate ser 37 °C. Ao contrário dos protocolos previamente relatados, a altura do reservatório não precisa de ser mudada. Lave o aparelho Langendorff com 70% de etanol seguido por dois enxaguamentos com água destilada dupla autolavada. Após a lavagem, encha o reservatório com KHB-HB e oxigena com 100% de oxigênio. Prime o sistema, permitindo khb-hb oxigenado para primeiro fluir em um copo de 100 mL. Uma vez que 50 mL de solução fluiu para o copo, mudar a posição de 3 vias stop-galo para parar o fluxo do reservatório KHB-HB. Despeje 50 mL de KHB-HB oxigenado do copo no reservatório de colagem. Deixe o dreno KHB-HB do reservatório de digestão até 5 mL permanece no reservatório de colagem. Ao priming o reservatório da colagem, comute a torneira do batente de 3 vias repetidamente entre reservatórios para permitir que as linhas degas. Depois que o sistema é preparado, recorde usar a armadilha degassing situada sobre a bobina de aquecimento para permitir que todo o ar restante saia do sistema. Faça a solução de colagem. Para ratos combinam 100 mg de colagenase tipo II, 100 mL de KHB-HB oxigenado, e 2 frascos do estoque blebbistain. Para camundongos, combinar 100 mg de colagenase tipo II, 40 mL de KHB-HB oxigenado, e 2 frascos do estoque blebbistain. Uma vez misturado, a solução deve ser estável para 1 h.NOTA: Viabilidade de miócito pode variar entre lotes de colagem tipo II. Aproveite um programa de amostragem de colagem para testar muito antes de encomendar em massa. 3. Isolamento de Miócito Injete o animal com 1.000 U de heparina. Espere 5 min.NOTA: Ratos e ratos de qualquer idade podem ser usados. No entanto, em geral, quanto mais velho ou mais doente o animal, menor o rendimento de miócito. Sacrifique o animal primeiro anestesiando-o com isoflurane usando o método de queda aberta (1 cc de Isoflurane por volume de 500 cc) antes de eutanásia do animal com uma mistura pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal). Rapidamente extirpar o coração, primeiro agarrando a pele acima do processo xifórido. Com a tesoura de íris, faça uma pequena incisão imediatamente abaixo do processo xifórido e puxe a pele para cima em direção à cabeça expondo a pele. Pegue o processo xifórico e corte o diafragma expondo a cavidade torácica. Faça uma incisão do alçapão, puxe o esterno para trás usando um hemostat, e use os fórceps curvos para extirpar o coração acima da aorta ascendente e coloque no frio KHB-HB. Cannulate o coração usando um microscópio estéreo e fórceps número 5. Certifique-se de que o coração está submerso e a cânula foi preparada antes da excisão cardíaca para evitar embolias. Confirme o posicionamento adequado da cânula visualizando a ponta da cânula aproximadamente 1 mm acima da inserção da aorta no ventrículo.NOTA: Quanto mais rápido o tempo de canulação, melhor o rendimento do miócito. Comece o fluxo de KHB-HB girando o stopcock no Langendorff. Ligue a cânula ao Langendorff. Perfuse o coração por 5 min.NOTA: Uma vez que a perfusão é fornecida por um sistema baseado em gravidade, o fluxo através do coração será uma função da adesão da artéria coronária. Troque a perfusão do reservatório KHB-HB para o reservatório tampão de digestão. Uma vez que o buffer de digestão atinge o coração, definir um tempora (5 min para o rato ou 15 min para o rato). Certifique-se de recolher o perfusato em um copo estéril de 100 mL. Reencher o reservatório tampão de digestão, conforme necessário com o perfusate até que o tempo de digestão expirou. Após a digestão, separe as câmaras do coração com fórceps e a tesoura da íris em um copo estéril de 100 mL. Coloque cada câmara em um poço separado de uma placa de seis poços. Despeje 5 mL de solução de colagem em cada poço. Imediatamente começar a picar o tecido cardíaco usando uma tesoura. Os pedaços do tecido devem ser aproximadamente 1 mm3. Usando pipetas de transferência estéreis, triturar suavemente o tecido cardíaco picado. A solução deve ficar turva. Uma vez que os pedaços do tecido se tornam brancos e plumosos, examine as pilhas usando um microscópio invertido. Se o número de células viáveis for superior a 80%, prossiga para esticar as células em um tubo cônico de 50 mL usando um filtro de células de 100 μm. Use um tubo diferente e filtro para cada câmara do coração. Se o número de células viáveis for inferior a 80%, verifique o tempo necessário para se cannular. Se o tempo de cannulação é mais de 5 min, tente outro coração. Se não, ensaio novos lotes colagem através do programa de amostragem de colagem. Pelotas as células por centrífuga em 215 x g por 2 min. A pelota deve ser compacta e não solta. Se a pelota estiver solta, a preparação contém muitas células mortas. Em uma capa da cultura do tecido, resuspenda a pelota em 10 mL do amortecedor de parada. Pelotas as células por centrífuga em 215 x g por 2 min. A pelota deve ser compacta e não solta. Se a pelota estiver solta, a preparação contém muitas células mortas. Resuspenda as células em 5 mL de tampão de revestimento. Realizar uma contagem celular. Ajuste os mililitros de tampão de revestimento para alcançar uma concentração final de miócito de 2 x 104 células por mL. Retire os lábios revestidos de laminado da incubadora. Aspirar a gota de laminado. Placa 200 μL de suspensão de miócito em cada deslizamento de capa. Coloque em uma incubadora de 37 °C (21% O2,5% CO2)para 2 h para permitir o apego. Após 2 h, aspirar as células não anexadas, adicionar 2 mL de mídia cultural, e cultura por até 4 dias. 4. Carregamento de tine Fura-2 Faça uma solução de estoque de 2 m fura-2 acetoximethyl ester (fura-2 AM), adicionando 25 μL de DMSO a 50 μg de pó de fura-2 AM (1 frasco). Aliquot em 6 μL aliquots. Tome 1 aliba de fura-2 AM e adicione a 6 mL de revestimento médio. Vórtice para misturar. Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Mídia aspirate. Adicione 1 mL de fura-2 mistura de mídia para cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min. Aspirate fura-2 mistura de mídia e adicionar 1 mL da solução do Tirode para cada bem. Cubra com papel alumínio. Espere 20 min à temperatura ambiente para permitir a lavagem de tine antes da imagem. 5. Carregamento de corantes Fluo-4 Faça uma solução de estoque de 1,82 m fluo-4 acetoximethyl ester (fluo-4 AM), adicionando 25 μL de DMSO a 50 μg de pó fluo-4 AM (1 frasco). Aliquot em 8.333 μL alíquotas. Tome 1 alibado de estoque fluo-4 AM e adicione a 6 mL de revestimento médio. Vórtice para misturar. Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Mídia aspirate. Adicione 1 mL de fluo-4 am mistura de mídia para cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min. Aspirate fluo-4 AM mistura de mídia e adicionar 1 mL da solução do Tirode para cada bem. Cubra com papel alumínio. Espere 20 min à temperatura ambiente para permitir a lavagem de tine antes da imagem. 6. Carregamento potencial da tintendência da membrana Remover componente A e componente B do kit potencial de membrana. Em um tubo cônico de 15 mL, combine 50 μL do componente B e 5 μL do componente A. Vortex para misturar. Adicione 10 mL de mídia de revestimento para o tubo cônico de 15 mL contendo a mistura de tinpa de tensão. Vórtice para misturar. Retire 1seis pratos de miócitos da incubadora. Aspiratee a mídia. Adicione 800 μL da mistura potencial da tinlidade da membrana a cada poço. Placa de cobertura com papel alumínio, deixe a placa à temperatura ambiente, e esperar 15 min. A mistura de mídia de tine aspirado aspirataria e adiciona 1 mL da solução do Tiroda modificado a cada poço. Cubra com papel alumínio. 7. Fotometria e carga acoplado device recordings Ligue o equipamento na seguinte ordem: microscópio, lâmpada de arco, hiperswitch, sistema de interface de fluorescência, fornecimento de energia Myocam, estimulador de campo e computador. Certifique-se de que os conjuntos de filtros de excitação/emissão são apropriados para o tinuoso de imagem.NOTA: Fura-2 está animado em 340 nm e 380 nm de luz. Ele emite a 510 nm de luz. Fluo-4 e a tintendência de membrana de tensão são excitadas em 485 nm da luz e emitem-se em 520 nm da luz. Prime o sistema girando sobre o vácuo, abrindo inteiramente a braçadeira da mangueira, e mergulhando delicadamente cada seringa de 60 mL que está sendo usada no reluzido. Para gravações de cálcio usar a solução do Tirode. Para gravações de tensão, use a solução do Tirode modificado. Ligue o aquecedor e ajuste o fluxo ajustando a braçadeira do rolo na tubulação da perfusão. Faça gravações a 36 ± 1 °C. Abra o software de aquisição. Certifique-se de que os parâmetros são definidos para o corante de imagem correto. No escuro, retire a folha da placa de seis poços e coloque um coverslip na câmara de ritmo. Certifique-se de que o estimulador está desligado durante esta etapa. Concentre-se nos miócitos usando o objetivo 10x. Uma vez em foco, começar a andar de campo estimulante em 1 Hz, 0,2 V. Aumentar gradualmente a tensão até 1:1 ritmo é obtido. Em seguida, aumentar a tensão até 1,5 x o limiar é atingido.NOTA: Como o acoplamento de excitação-contração é dependente da temperatura, certifique-se de que as células foram perfundidas por 15 min antes da gravação. Isso permite que os miócitos se recuperem do choque de ir da temperatura ambiente de volta para 37 °C, bem como células vagamente ligadas para flutuar para longe. Mude do objetivo 10x para o objetivo 40x. Concentre-se em uma célula que está seguindo um ritmo 1:1. Ajuste as máscaras plásticas assim que somente uma pilha está no campo de vista. Usando o software, coloque a área de caixa de interesse em sarcomeres bem definidos. Inicie o software de aquisição para iniciar a luz de excitação. Usando os filtros de densidade neutra, ajuste a configuração de intensidade de acordo para obter uma REEm adequada.