Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

Todos los métodos y procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Case Western Reserve University. 1. Preparación de soluciones, instrumentos y covers NOTA: 1x soluciones se pueden utilizar hasta un mes. Hacer 10x Krebs-Henseleit tampón HEPES tampón sin calcio (KHB-HB) mediante la adición de 68.96 g de NaCl, 3,57 g de KCl, 59,58 g de HEPES, 2,18 g de K2HPO4, 3,08 g de MgSO4 y 19,82 g de glucosa a 800 ml de agua destilada doble en un matraz de 1.000 ml. Una vez que el contenido esté completamente disuelto, suba al volumen en un matraz volumétrico de 1.000 ml.NOTA: La solución tradicional Krebs Henseleit utiliza bicarbonato de sodio como tampón y la solución de este protocolo utiliza la solución Krebs Henseleit con búfer HEPES. La solución es estable durante 6 meses si se filtra estérilmente. Hacer 10x solución de Tyrode añadiendo 86,51 g de NaCl, 0,552 g de NaH2PO4, 2,03 g de MgCl2, 9,91 g de glucosa, 4,03 g de KCl, 2,65 g de CaCl2y 35,76 g de HEPES a 800 ml de agua destilada doble en un lote de 100 ml. Después de que el contenido esté completamente disuelto, suba al volumen en un matraz volumétrico de 1000 ml.NOTA: La solución es estable durante 6 meses si se filtra estérilmente. Hacer 1x KHB-HB midiendo 100 ml del stock 10x y añadiendo a 875 ml de agua destilada doble en un matraz de 1.000 ml. Colocar el matraz en un baño de agua a 37oC. Una vez que la solución haya alcanzado los 37 oC, utilice NaOH para aumentar el pH a 7,39. Después de ajustar el pH, lleve la solución al volumen en un matraz volumétrico de 1000 ml. Filtrar estérilmente la solución utilizando un sistema de filtración al vacío. Haga la solución de 1x Tyrode midiendo 100 ml del stock 10x y añadiendo a 875 ml de agua destilada doble en un matraz de 1.000 ml. Colocar el matraz en un baño de agua a 37oC. Una vez que la solución haya alcanzado los 37 oC, utilice NaOH para aumentar el pH a 7,39. Después de ajustar el pH, lleve la solución al volumen en un matraz volumétrico de 1.000 ml. Filtro estéril mediante un sistema de filtración al vacío. Haga 1 solución modificada de Tyrode midiendo 100 ml del stock 10x y añadiendo a 875 ml de agua destilada doble en un matraz de 1.000 ml. Disolver 3,07 g de L-glutatión reducido en matraz. Colocar el matraz en un baño de agua a 37oC. Una vez que la solución haya alcanzado los 37 oC, utilice NaOH para aumentar el pH a 7,39. Después de ajustar el pH, lleve la solución al volumen en un matraz volumétrico de 1.000 ml. Filtrar estérilmente la solución utilizando un sistema de filtración al vacío. Hacer 100 mM de solución de stock de blebbistatin añadiendo 855 ml de dimetil sulfóxido (DMSO) a 25 mg de polvo. Alícuota en incrementos de 20 l y almacenar en un congelador de -80 oC durante un máximo de seis meses. Realice el tampón de parada añadiendo 2 g de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 vial de blebbistatin alíclavado a 100 ml de 1x KHB-HB y filtre estérilmente la solución utilizando un sistema de filtración al vacío. Haga el tampón de chapado añadiendo 5 ml de suero bovino fetal y 1 vial de la reserva de blebbistatina alíccada a 95 ml de M199 HEPES. Filtrar estérilmente la solución utilizando un sistema de filtración al vacío. Realice el tampón de cultivo de miocitos añadiendo un vial de 1 vial del stock de blebbistatina alícteado y 4 mls de penicilina-estreptomicina a 396 ml de M199 (25 mM HEPES). Filtrar estérilmente la solución utilizando un sistema de filtración al vacío. Autoclave 2 pares de pinzas Dumont, 2 pares de tijeras curvas Iris, 2 hemostats, un par de fórceps de cirugía plástica, 6 suturas de seda trenzada negra 4-0 dispuestas para ser utilizadas como un nudo quirúrgico de doble tiro, y cuatro vasos de 100 ml. Esterilice 22 x 22 mm2 tapas de vidrio. En primer lugar, coloque una sola tapa en cada pocal de un plato de seis pocillos. Después, con la tapa quitada, encienda la lámpara UV del gabinete de bioseguridad y exponga los cubreobjetos a la luz UV durante 1 h. Haga que la solución de stock de laminina de trabajo descontece primero la botella sobre hielo. Añadir el contenido de una botella a suficiente salina estéril de fosfato (PBS) para alcanzar una concentración final de 0,04 mg/ml. Alícuota de 1,3 ml en tubos de centrífuga autoclave dosde de 1,5 ml. Conservar a -80oC.NOTA: Cada tubo tiene suficiente laminin para una sola placa de seis pocillos. Evite múltiples ciclos de congelación de descongelación. Cubra esterilizado con recubrimiento descongelando primero la solución laminina de trabajo sobre hielo. Usando una pipeta P1000, aspirar 200 l de laminina. Arrastre suavemente la punta de la pipeta a lo largo de un borde de la cubierta para permitir que la acción capilar extraiga una cantidad minúscula de laminina para facilitar la fijación del cubreobjetos a la placa de seis pocillos. Luego, expulse el laminin restante en el centro de la cubierta. En un movimiento circular, extienda la gota de laminina a través de la cubierta. Colocar en una incubadora de 37oC al menos 1 h y hasta 24 h antes del aislamiento. 2. Preparación del Aparato Langendorff NOTA: Los componentes individuales del aparato Langendorff utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de materiales. Encienda el baño de agua circulante. Ajuste la temperatura para que perfusate tenga una temperatura de 37 oC.NOTA: Con los depósitos de solución ajustados a una altura de 60 cm, el agua circulante debe ajustarse a 41 oC para que el perfusado sea de 37 oC. A diferencia de los protocolos notificados anteriormente, no es necesario cambiar la altura del depósito. Enjuague el aparato Langendorff con un 70% de etanol seguido de dos enjuagues con agua destilada doble autoclave. Después de enrestar, llene el depósito con KHB-HB y oxigene con 100% de oxígeno. Prepara el sistema permitiendo que el KHB-HB oxigenado fluya primero hacia un vaso de precipitados de 100 ml. Una vez que 50 ml de solución haya fluyedo en el vaso de precipitados, cambie la posición de parada de 3 vías para detener el flujo desde el depósito KHB-HB. Vierta 50 ml de KHB-HB oxigenado desde el vaso de precipitados en el depósito de colagenasa. Deje que el KHB-HB drene del depósito de digestión hasta que queden 5 ml en depósito de colagenasa. Mientras ceba el depósito de colagenasa, cambie la polla de parada de 3 vías repetidamente entre los reservorios para permitir que las líneas desgasifiquen. Después de que el sistema esté preparado, recuerde utilizar la trampa de desgasificación situada en la parte superior de la bobina de calentamiento para permitir que el aire restante salga del sistema. Hacer la solución de colagenasa. Para ratas combinan 100 mg de colágeno tipo II, 100 ml de KHB-HB oxigenado y 2 viales de la población de blebbistain. Para ratones, combine 100 mg de colagenasa tipo II, 40 ml de KHB-HB oxigenado y 2 viales de la población de blebbistain. Una vez mezclado, la solución debe ser estable durante 1 h.NOTA: La viabilidad de los miocitos puede variar entre lotes de colagenasa tipo II. Aproveche un programa de muestreo de colagenasa para probar mucho antes de ordenar a granel. 3. Aislamiento de myocitos Inyectar al animal 1.000 U de heparina. Espere 5 minutos.NOTA: Se pueden utilizar ratones y ratas de cualquier edad. Sin embargo, en general el animal mayor o más enfermo, menor es el rendimiento de los miocitos. Sacrificar al animal anestesiando primero con isoflurano utilizando el método de gota abierta (1 cc de isoflurano por volumen de 500 cc) antes de eutanasiarlo con una mezcla pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal). Exbote rápidamente el corazón agarrando primero el pelaje por encima del proceso de xifoide. Con las tijeras de iris, haga una pequeña incisión inmediatamente debajo del proceso de xifoide y tire del pelaje hacia arriba hacia la cabeza exponiendo la piel. Coge el proceso de xifoide y corta el diafragma exponiendo la cavidad torácica. Haga una incisión de la trampilla, tire del esternón hacia atrás usando un hemostat, y use los fórceps curvos para extirpar el corazón por encima de la aorta ascendente y colóquelo en frío KHB-HB. Cannute el corazón con un microscopio estéreo y el nórforme número 5. Asegúrese de que el corazón esté sumergido y de que la cánula esté preparada antes de la escisión cardíaca para prevenir los émbolos. Confirme el posicionamiento adecuado de la cánula visualizando la punta de la cánula aproximadamente 1 mm por encima de la inserción aórtica en el ventrículo.NOTA: Cuanto más rápido sea el tiempo de cannulación, mejor será el rendimiento de los miocitos. Comience el flujo de KHB-HB girando el tapón en el Langendorff. Conecte la cánula al Langendorff. Perpecar el corazón durante 5 min.NOTA: Dado que la perfusión es suministrada por un sistema basado en la gravedad, el flujo a través del corazón será una función del cumplimiento de las arterias coronarias. Cambie la perfusión del depósito KHB-HB al depósito del búfer de digestión. Una vez que el tampón de digestión llegue al corazón, ajuste un temporizador (5 min para el ratón o 15 min para la rata). Asegúrese de recoger el perfusado en un vaso de precipitados estéril de 100 ml. Rellene el depósito del tampón de digestión según sea necesario con el perfusato hasta que el tiempo de digestión haya expirado. Después de la digestión, separar las cámaras del corazón con fórceps y las tijeras de iris en un vaso estéril de 100 ml. Coloque cada cámara en un pozo separado de una placa de seis pocillos. Vierta 5 ml de solución de colagenasa en cada poca. Comience inmediatamente a picar el tejido cardíaco con tijeras. Los trozos de tejido deben ser de aproximadamente 1 mm3. Con pipetas de transferencia estériles, triturar suavemente el tejido cardíaco picado. La solución debe volverse turbia. Una vez que los trozos de tejido se vuelvan blancos y emplumados, examine las células con un microscopio invertido. Si el número de células viables es superior al 80%, proceda a tensar las células en un tubo cónico de 50 ml utilizando un colador de células de 100 m. Utilice un tubo y un colador diferentes para cada cámara del corazón. Si el número de células viables es inferior al 80%, compruebe el tiempo que tardó en cándar. Si el tiempo de cannulación es de más de 5 min, prueba con otro corazón. Si no es así, ensayo nuevos lotes de colagenasa a través del programa de muestreo de colagenasa. Peletizar las células centrifugando a 215 x g durante 2 min. El pellet debe ser compacto y no suelto. Si el pellet está suelto, la preparación contiene muchas células muertas. En una capucha de cultivo de tejido, resuspenda el pellet en 10 ml de tampón de parada. Peletizar las células centrifugando a 215 x g durante 2 min. El pellet debe ser compacto y no suelto. Si el pellet está suelto, la preparación contiene muchas células muertas. Resuspenda las celdas en 5 ml de tampón de chapado. Realice un recuento de celdas. Ajuste los mililitros de tampón de chapado para alcanzar una concentración final de miocitos de 2 x 104 células por ml. Retire los revestimientos de laminina de la incubadora. Aspira rinde a la gota de laminina. Placa 200 l de suspensión de miocitos en cada cubreobjetos. Colocar en una incubadora de 37oC (21% O2, 5% CO2) durante 2 h para permitir la fijación. Después de 2 h, aspirar las celdas no conectadas, añadir 2 ml de medios de cultivo, y el cultivo durante un máximo de 4 días. 4. Carga de tinte Fura-2 Hacer una solución de 2 mM de éster de acetoximetil fura-2 (fura-2 AM) añadiendo 25 ml de DMSO a 50 g de polvo fura-2 AM (1 vial). Alícuota en alícuotas de 6 l. Tomar 1 alícuota de fura-2 AM y añadir a 6 ml de medio de chapado. Vórtice para mezclar. Retire 1 placa de seis pocillos de la incubadora. Aspirar a los medios de comunicación. Añadir 1 ml de mezcla de medios fura-2 a cada poca. Cubra la placa con papel de aluminio, deje la placa a temperatura ambiente y espere 15 minutos. Aspirar la mezcla de medios fura-2 y añadir 1 ml de la solución de Tyrode a cada poca. Cubrir con papel de aluminio. Espere 20 minutos a temperatura ambiente para permitir el lavado de tinte antes de la toma de imágenes. 5. Carga de tinte Fluo-4 Hacer una solución de éster de fluo-4 de 1,82 mM fluo-4 (fluo-4 AM) añadiendo 25 ml de DMSO a 50 g de polvo fluo-4 AM (1 vial). Alícuota en alícuotas de 8.333 ol. Tomar 1 alícuota de stock fluo-4 AM y añadir a 6 ml de medio de chapado. Vórtice para mezclar. Retire 1 placa de seis pocillos de la incubadora. Aspirar a los medios de comunicación. Agregue 1 ml de mezcla de medios fluo-4 AM a cada poca. Cubra la placa con papel de aluminio, deje la placa a temperatura ambiente y espere 15 minutos. Aspirar la mezcla de medios fluo-4 AM y añadir 1 ml de solución de Tyrode a cada poca. Cubrir con papel de aluminio. Espere 20 minutos a temperatura ambiente para permitir el lavado de tinte antes de la toma de imágenes. 6. Carga de tinte potencial de membrana Retire el componente A y el componente B del kit de potencial de membrana. En un tubo cónico de 15 ml, combine 50 ml del componente B y 5 l del componente A. Vortex para mezclar. Añadir 10 ml de soporte de chapado al tubo cónico de 15 ml que contiene la mezcla de tinte de tensión. Vórtice para mezclar. Retire 1 placa de seis pocillos de la incubadora. Aspira a los medios de comunicación. Añadir 800 l de la mezcla de colorante potencial de membrana a cada poca. Cubra la placa con papel de aluminio, deje la placa a temperatura ambiente y espere 15 minutos. Aspirar mezcla de medios de tinte y añadir 1 mL de solución de Tyrode modificado a cada poca. Cubrir con papel de aluminio. 7. Grabaciones de dispositivos acoplados de fotometría y carga Encienda el equipo en el siguiente orden: microscopio, lámpara de arco, hiperinterruptor, sistema de interfaz de fluorescencia, fuente de alimentación Myocam, estimulador de campo y ordenador. Asegúrese de que los conjuntos de filtros de excitación/emisión sean adecuados para el tinte de imagen.NOTA: Fura-2 se excita a 340 nm y 380 nm de luz. Emite a 510 nm de luz. Fluo-4 y el tinte de membrana de voltaje se excitan a 485 nm de luz y emiten a 520 nm de luz. Apriete el sistema encendiendo el vacío, abriendo completamente la abrazadera de la manguera y hundiendo suavemente cada jeringa de 60 ml que se utiliza en el colector. Para las grabaciones de calcio, utilice la solución de Tyrode. Para grabaciones de voltaje, utilice la solución modificada de Tyrode. Encienda el calentador y ajuste el flujo ajustando la abrazadera del rodillo en el tubo de perfusión. Realice grabaciones a 36 oC. Abra el software de adquisición. Asegúrese de que los parámetros están configurados para el tinte de imagen correcto. En la oscuridad, retire la lámina de la placa de seis pocillos y coloque un cubreobjetos en la cámara de ritmo. Asegúrese de que el estimulador esté apagado durante este paso. Concéntrese en los miocitos utilizando el objetivo 10x. Una vez enfocado, comience a ritmo estimulando el campo a 1 Hz, 0,2 V. Aumente gradualmente la tensión hasta obtener el ritmo 1:1. A continuación, aumente la tensión hasta que se alcance el umbral 1,5 veces.NOTA: Debido a que el acoplamiento excitación-contracción depende de la temperatura, asegúrese de que las células se han perfundido durante 15 minutos antes de la grabación. Esto permite que los miocitos se recuperen del impacto de volver a la temperatura ambiente a 37 oC, así como que las células unidas libremente flotan. Cambia del objetivo 10x al objetivo 40x. Concéntrese en una celda que está siguiendo un ritmo de 1:1. Ajuste las sombras de plástico para que solo haya una celda en el campo de visión. Usando el software, coloque el área de interés en sarcomeres bien definidos. Inicie el software de adquisición para iniciar la luz de excitación. Usando los filtros de densidad neutra, ajuste el ajuste de intensidad en consecuencia para obtener un SNR adecuado.