İzole Murine Ventriküler Miyositlerin Optik Görüntülemesi

Bu protokolde açıklanan tüm yöntem ve prosedürler Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Çözelti, Alet ve Kapakların Hazırlanması NOT: 1x çözümleri bir aya kadar kullanılabilir. Kalsiyum olmadan 10x Krebs-Henseleit tampon HEPES tampon olun (KHB-HB) NaCl 68.96 g ekleyerek, 3.57 g KCl, 59.58 g HEPES, 2.18 g K2HPO4,MgSO4 3.08 g ve 19.82 g glukoz 800 mL çift distile su 1.000 mL şişe. İçeriği tamamen çözüldükten sonra, 1.000 mL hacimli şişede hacim haline getirin.NOT: Geleneksel Krebs Henseleit çözeltisi tampon olarak sodyum bikarbonat kullanır ve bu protokoldeki çözelti HEPES tamponu ile Krebs Henseleit çözeltisi kullanır. Steril filtre edilirse çözelti 6 ay stabildir. NaCl 86.51 g ekleyerek 10x Tyrode çözeltisi olun, NaH 0.552 g2PO4,MgCl2 2.03 g , glikoz 9.03 g, KCl 4.03 g,CaCl2 2 2.65 g , ve HEPES 35.76 g 800 mL çift distile su 1000 mL flask. İçeriği tamamen çözüldükten sonra, 1000 mL hacimli şişede sese kadar getirin.NOT: Steril filtre edilirse çözelti 6 ay stabildir. 10x stoğun 100 mL’ini ölçerek ve 1.000 mL’lik bir şişede 875 mL çift distile suya ekleyerek 1x KHB-HB yapın. Şişeyi 37 °C su banyosuna yerleştirin. Çözelti 37 °C’ye ulaştığında, pH’ı 7,39’a çıkarmak için NaOH kullanın. pH’ı ayarladıktan sonra, 1000 mL hacimli şişede çözeltiyi hacim haline getirin. Steril filtre çözeltisi vakum filtrasyon sistemi kullanarak. 10x stoğun 100 mL’ini ölçerek ve 1.000 mL’lik bir şişeye 875 mL çift distile su ekleyerek 1x Tyrode’un çözeltisini yapın. Şişeyi 37 °C su banyosuna yerleştirin. Çözelti 37 °C’ye ulaştığında, pH’ı 7,39’a çıkarmak için NaOH kullanın. pH’ı ayarladıktan sonra, 1.000 mL hacimli şişede çözeltiyi hacimhaline getirin. Vakum lu filtrasyon sistemi kullanılarak steril filtre. 10x stoğun 100 mL’ini ölçerek ve 1.000 mL’lik bir şişeye 875 mL çift distile su ekleyerek 1x modifiye tyrode çözeltisini yapın. Flask azaltılmış L-glutatyon 3.07 g çözünür. Şişeyi 37 °C su banyosuna yerleştirin. Çözelti 37 °C’ye ulaştığında, pH’ı 7,39’a çıkarmak için NaOH kullanın. pH’ı ayarladıktan sonra, 1.000 mL hacimli şişede çözeltiyi hacimhaline getirin. Steril filtre çözeltisi vakum filtrasyon sistemi kullanarak. 25 mg toz 855 μL dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek 100 mM blebbistatin stok çözeltisi yapın. Aliquot 20 μL artışlarla dışarı ve altı aya kadar -80 °C dondurucuda saklayın. 1x KHB-HB 100 mL’ye 2 g büyükbaş serum albumin (BSA) ve 1 şişe aliquoted blebbistatin stoğu ekleyerek tamponu durdurun ve vakum filtrasyon sistemi kullanarak çözeltiyi steril filtreleyin. M199 HEPES’in 95 mL’sine 5 mL fetal büyükbaş serum ve 1 şişe aliquoted blebbistatin stoğu ekleyerek kaplama tamponu yapın. Steril filtre çözeltisi vakum filtrasyon sistemi kullanarak. M199 ‘un (25 mM HEPES) 396 mL’sine 1 şişe aliquoted blebbistatin stoğu ve 4 mls penisilin-streptomisin ekleyerek miyosit kültür tamponu yapın. Steril filtre çözeltisi vakum filtrasyon sistemi kullanarak. Otoklav 2 çift Dumont cımbız, Iris kavisli makas 2 çift, 2 hemostats, plastik cerrahi forceps bir çift, 6 siyah örgülü ipek 4-0 dikiş ler cerrahi çift atmak düğüm olarak kullanılmak üzere düzenlenmiş ve dört 100 mL beaers. 22 x 22 mm2 cam kapaklı kapakları sterilize edin. İlk olarak, altı kuyu plaka her kuyuya tek bir coverslip yerleştirin. Daha sonra, kapak çıkarıldığında, biyogüvenlik kabininin UV lambasını açın ve kapakları 1 saat uv ışığına maruz bırakın. Önce buz üzerinde şişe eriterek çalışma laminin stok çözüm olun. 0.04 mg/mL nihai konsantrasyonulaşmak için yeterli soğuk steril fosfat tamponlu salin (PBS) için bir şişe içeriğini ekleyin. Aliquot dışarı 1.3 μL otoklavlı 1.5 mL santrifüj tüpler içine. -80 °C’de saklayın.NOT: Her tüp tek bir altı kuyu plakası için yeterli laminin vardır. Birden çok donma çözülme döngülerinden kaçının. Kat önce buz üzerinde çalışan laminin çözeltisi eriterek coverslip sterilize. P1000 pipet kullanarak, 200 μL laminin aspire edin. Pipet ucunu kapak kaymasının bir kenarı boyunca hafifçe sürükleyin ve kılcal damar hareketinin altı kuyu plakasına kapak kayması eki kolaylaştırmak için küçük miktarda laminin çıkarmasını bekleyin. Sonra, kapak ortasında kalan laminin dışarı. Dairesel bir hareketle, laminin damlacıkkapak boyunca yayıldı. İzolasyondan önce en az 1 saat ve 24 saate kadar 37 °C’lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. 2. Langendorff Aparatının Hazırlanması NOT: Bu protokolde kullanılan Langendorff cihazlarınıntek tek bileşenleri Malzeme Tablosu’nda listelenmiştir. Dolaşan su banyosunu açın. Sıcaklığı 37 °C’lik bir sıcaklığa sahip olacak şekilde ayarlayın.NOT: Çözelti rezervuarları 60 cm yüksekliğe ayarlı, perfusat 37 °C olması için sirkülasyon su doğum 41 °C olarak ayarlanması gerekir. Daha önce bildirilen protokollerin aksine, rezervuarYüksekliğinin değiştirilmesi gerekmez. Langendorff cihazını etanolle durulayın ve ardından otoklavlı çift distile su ile iki durulama. Durulama dan sonra, KHB-HB ile rezervuar doldurun ve% 100 oksijen ile oksijen. Oksijenli KHB-HB’nin ilk olarak 100 mL’lik bir kabın içine akmasına izin vererek sistemi asallayın. 50 mL çözelti kabına aktıktan sonra, KHB-HB rezervuarından gelen akışı durdurmak için 3 yönlü stop-cock pozisyonunu değiştirin. Kabından kollajenaz haznesine 50 mL oksijenli KHB-HB dökün. 5 mL kollajenaz rezervuar kalır kadar sindirim rezervuar ıNDAN KHB-HB drenaj sağlar. Kollajenaz rezervuar priming sırasında, çizgiler degas izin vermek için rezervuarlar arasında tekrar tekrar 3-yol stop horoz geçiş. Sistem astarlandıktan sonra, kalan havanın sistemden çıkmasına izin vermek için ısıtma bobininin üstünde bulunan gaz giderme kapanını kullanmayı unutmayın. Kollajenaz çözeltisini yapın. Sıçanlar için tip II kollajenaz 100 mg birleştirmek, oksijenli KHB-HB 100 mL, ve blebbistain stok 2 şişeleri. Fareler için, tip II kollajenaz 100 mg birleştirmek, oksijenli KHB-HB 40 mL, ve blebbistain stok 2 şişeleri. Bir kez karıştırılır, çözelti 1 saat için kararlı olmalıdır.NOT: Miyosit canlılığı tip II kollajenaz kuraları arasında değişebilir. Toplu sipariş önce çok test etmek için bir kollajenaz örnekleme programı yararlanın. 3. Miyosit İzolasyon Hayvana 1000 U heparin enjekte et. 5 dk bekleyin.NOT: Her yaştaki fare ve sıçanlar kullanılabilir. Ancak, genel olarak yaşlı veya daha fazla hasta hayvan, düşük miyosit verimi. Bir pentobarbital karışım (150 mg / kg intraperitoneal) ile hayvan ötenazi önce açık-damla yöntemi (500 cc hacim başına Isoflurane 1 cc) kullanarak isoflurane ile anestezi ile ilk hayvan kurban. Hızlı bir şekilde ilk xiphoid süreci üzerinde kürk kapma tarafından kalp çıkarmak. Iris makas ile, xiphoid sürecinin hemen altında küçük bir kesi yapmak ve deri açığa baş doğru yukarı doğru kürk çekin. Ksifoid işlemini yakalayın ve göğüs boşluğuna maruz kalan diyaframı kesin. Bir tuzak kapı kesi yapmak, bir hemostat kullanarak göğüs geri çekin, ve soğuk KHB-HB artan aort üzerinde kalp çıkarmak ve yer için kavisli forceps kullanın. Bir stereo mikroskop ve 5 numaralı bürlipler kullanarak kalbi kanüle. Kalbin sular altında olduğundan ve kanüle emboli önlemek için kalp eksizyonu önce astarlı olduğundan emin olun. Kanülün ucunu ventriküle aort eklemenin yaklaşık 1 mm üzerinde görselleştirerek kanülün doğru konumlandırın.NOT: Kanülasyon süresi ne kadar hızlı sayılsa, miyosit verimi de o kadar iyi. Langendorff üzerinde stopcock döndürerek KHB-HB akışını başlatın. Kanülleri Langendorff’a bağlayın. 5 dakika için kalp perfuse.NOT: Perfüzyon yerçekimi ne dayalı bir sistem tarafından sağlandığı için, kalpten akan akış koroner arter uyumunun bir fonksiyonu olacaktır. KHB-HB rezervuarından sindirim tampon haznesine perfüzyon uyguluyoruz. Sindirim tamponu kalbe ulaştığında, bir zamanlayıcı ayarlayın (fare için 5 dk veya sıçan için 15 dk). Steril 100 mL kabında perfusate toplamak için emin olun. Sindirim süresi dolana kadar perfusate ile gerektiği gibi sindirim tampon rezervuar yeniden doldurun. Sindirimden sonra kalbin odalarını terlikli 100 mL kabında forceps ve iris makası ile ayırın. Her odayı altı kuyu tabağından ayrı bir kuyuya yerleştirin. Her kuyuya 5 mL kollajenaz çözeltisi dökün. Hemen makas kullanarak kalp dokusu kıyma başlar. Doku parçaları yaklaşık 1 mm3olmalıdır. Steril transfer pipetleri kullanarak, hafifçe kıyılmış kalp dokusu triturate. Çözüm bulutlu dönecek. Doku parçaları beyaz ve tüylü hale geldikten sonra, ters bir mikroskop kullanarak hücreleri inceleyin. Canlı hücre sayısı ‘den fazlaysa, hücreleri 100 μm’lik bir hücre süzgeci kullanarak 50 mL konik tüpe zorlayın. Kalbin her odası için farklı bir tüp ve süzgeç kullanın. Canlı hücre sayısı ‘den azsa, kanültinin ne kadar sürdüğünü kontrol edin. Kanülasyon süresi 5 dk’dan fazlaise, başka bir kalp deneyin. Değilse, kollajenaz örnekleme programı ile yeni kollajenaz çok say. 2 dk için 215 x g santrifüj ederek hücreleri pelet. Pelet kompakt ve gevşek olmamalıdır. Pelet gevşek ise, hazırlık birçok ölü hücreleri içerir. Bir doku kültürü başlık olarak, tampon durdurma 10 mL pelet resuspend. 2 dk için 215 x g santrifüj ederek hücreleri pelet. Pelet kompakt ve gevşek olmamalıdır. Pelet gevşek ise, hazırlık birçok ölü hücreleri içerir. Kaplama tamponunun 5 mL’lik hücrelerini yeniden askıya alın. Hücre sayımı gerçekleştirin. ML başına 2 x 104 hücreli son bir miyosit konsantrasyonuna ulaşmak için kaplama tamponunun mililitrelerini ayarlayın. Kuvözdeki laminin kaplı kapakları çıkarın. Laminin damlacıkaspire. Her kapak kapağında 200 μL miyosit süspansiyonplakası. 37 °C’lik bir kuluçka makinesine ( O2, %5 CO2)2 saat boyunca ilave yetirin. 2 saat sonra, bekar hücreleri aspire, kültür medya 2 mL ekleyin ve 4 güne kadar kültür. 4. Fura-2 Boya Yükleme 2 mM fura-2 asetoksimetil ester (fura-2 AM) 50 μg fura-2 tozuna (1 şişe) 25 μL DMSO ekleyerek stok çözeltisi yapın. Aliquot 6 μL aliquots içine dışarı. Fura-2 1 aliquot alın ve kaplama orta 6 mL ekleyin. Girdap karıştırmak için. Kuvözden 16 tane miyosit tabağı çıkarın. Aspire medya. Her kuyuya 1 mL fura-2 ortam karışımı ekleyin. Folyo ile kapak plaka, oda sıcaklığında plaka bırakın ve 15 dk bekleyin. Aspire fura-2 ortam karışımı ve her kuyuya Tyrode çözeltisi 1 mL ekleyin. Folyo ile kaplayın. Görüntülemeden önce boya yıkama için izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika bekleyin. 5. Fluo-4 Boya Yükleme 50 μg floro-4 tozuna (1 şişe) 25 μL DMSO ekleyerek 1,82 mM flor-4 asetoksimetil ester (flor-4 AM) stok çözeltisi yapın. Aliquot 8.333 μL aliquots içine dışarı. Fluo-4 stok 1 aliquot alın ve kaplama orta 6 mL ekleyin. Girdap karıştırmak için. Kuvözden 16 tane miyosit tabağı çıkarın. Aspire medya. Her kuyuya 1 mL flor-4 ortam karışımı ekleyin. Folyo ile kapak plaka, oda sıcaklığında plaka bırakın ve 15 dk bekleyin. Aspire floro-4 ortam karışımı ve her kuyuya 1 mL Tyrode çözeltisi ekleyin. Folyo ile kaplayın. Görüntülemeden önce boya yıkama için izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika bekleyin. 6. Membran Potansiyel Boya Yükleme Membran potansiyel kitinden Bileşen A ve Bileşen B’yi çıkarın. 15 mL konik bir tüpte, 50 μL b bileşeni ni ve 5 μL’lik a. vortex bileşenini birleştirmek. Voltaj boyakarışımı içeren 15 mL konik boruya 10 mL kaplama ortamı ekleyin. Girdap karıştırmak için. Kuvözden 16 tane miyosit tabağı çıkarın. Medyayı aspire edin. Her kuyuya membran potansiyel boya karışımından 800 μL ekleyin. Folyo ile kapak plaka, oda sıcaklığında plaka bırakın ve 15 dk bekleyin. Aspire boya medya karışımı ve her kuyuya modifiye-Tyrode çözeltisi 1 mL ekleyin. Folyo ile kaplayın. 7. Fotometri ve Şarj Birleştirilmiş Cihaz Kayıtları Aşağıdaki sırayla ekipmanı açın: mikroskop, ark lambası, hyperswitch, floresan arayüz sistemi, Myocam güç kaynağı, alan uyarıcı ve bilgisayar. Uyarma/emisyon filtre kümelerinin görüntüleme boyası için uygun olduğundan emin olun.NOT: Fura-2 340 nm ve 380 nm ışık ta heyecanlanır. 510 nm ışık yayır. Fluo-4 ve voltaj membran boyası 485 nm ışıkta heyecanlanır ve 520 nm ışıkta yakımır. Vakumu açarak, hortum kelepçesini tamamen açarak ve manifoldda kullanılan her 60 mL şırıngayı hafifçe dalarak sistemi asallayın. Kalsiyum kayıtları için Tyrode’un çözeltisi kullanılır. Voltaj kayıtları için modifiye Tyrode çözeltisi kullanın. Perfüzyon borusundaki silindir kelepçeyi ayarlayarak ısıtıcıyı açın ve akışı ayarlayın. 36 ± 1 °C’de kayıt yapın. Satın alma yazılımını açın. Parametrelerin doğru görüntüleme boyası için ayarlandıkundan emin olun. Karanlıkta, altı kuyu plakasından folyo çıkarın ve pacing odasına bir coverslip yerleştirin. Bu adımda uyarıcının kapalı olduğundan emin olun. 10x amacını kullanarak miyositlere odaklanın. Bir kez odak, 1 Hz alan uyarıcı tarafından pacing başlayın, 0.2 V. Yavaş yavaş 1:1 pacing elde edilene kadar voltajı artırmak. Daha sonra 1.5x eşik ulaşılır kadar voltajı artırın.NOT: Uyarma-daralma kaplini ısıya bağlı olduğundan, hücrelerin kayıt yapmadan önce 15 dakika boyunca perfüzyona maruz kaldığından emin olun. Bu, miyositlerin oda sıcaklığından 37 °C’ye geri dönmenin şokundan kurtulmasına ve gevşek bağlanmış hücrelerin uçup gitmelerine olanak sağlar. 10x nesnelden 40x hedefine geçin. 1:1’lik bir tempoyu takip eden bir hücreye odaklanın. Plastik tonları, görüş alanında yalnızca bir hücre olacak şekilde ayarlayın. Yazılımı kullanarak, iyi tanımlanmış sarcomeres üzerinde ilgi alanı kutusu yerleştirin. Uyarma ışığını başlatmak için satın alma yazılımını başlatın. Nötr yoğunluk filtrelerini kullanarak, yeterli bir SNR elde etmek için yoğunluk ayarını buna göre ayarlayın.