単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

このプロトコルに記載されているすべての方法と手順は、ケースウェスタンリザーブ大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. ソリューション、インスツルメンツ、カバースリップの作成 注:1xソリューションは、最大1ヶ月間使用することができます。 68.96 gのNaClを加えることで、カルシウムを含まない10xクレブス・ヘンセレイト緩衝液HEPES緩衝液(KHB-HB)を作り、 KClの3.57g、HEPESの59.58 g、K2 HPO4の2.18 g、MgSO4および19.82 gのグルコースの3.08gから1,000mLフラスコ中の二重蒸留水の800 mLに。内容物が完全に溶解したら、1,000mLの容積フラスコで体積に持ち出します。注:従来のクレブスヘンセレイト溶液は、バッファーとして重炭酸ナトリウムを使用し、このプロトコルのソリューションは、HEPESバッファーとクレブスヘンゼイト溶液を使用しています。溶液は滅菌濾過すれば6ヶ月間安定である。 NaClの86.51 g、NaH2PO4の0.552 g、MgCl2の2.03 g、ブドウ糖の9.91 g、KClの4.03 g、CaCl2の2.65 g、および35.76 gのHEPESを800mLに加えて10.76gのHEPESを100mLで二重蒸留水の800mLに加えて10.76gを作ります。内容物が完全に溶解したら、1000 mL体積フラスコで体積に持ち出します。注:溶液は、滅菌濾過した場合、6ヶ月間安定です。 10xストックの100 mLを測定し、1,000 mLフラスコに875mLの二重蒸留水を加えて1x KHB-HBを作ります。37°水浴中にフラスコを置きます。溶液が37°Cに達したら、NaOHを使用してpHを7.39に増やします。pHを調整した後、溶液を1000 mL体積フラスコで体積に持ち込みます。真空ろ過システムを使用して溶液を滅菌する。 10倍のストックの100 mLを測定し、1,000 mLのフラスコに875mLの二重蒸留水を加えて、1xタイローデの溶液を作ります。37°水浴中にフラスコを置きます。溶液が37°Cに達したら、NaOHを使用してpHを7.39に増やします。pHを調整した後、溶液を1,000mLの容積フラスコで体積に持ち込みます。真空ろ過システムを使用した滅菌フィルター。 10倍のストックの100 mLを測定し、1,000 mLのフラスコに875mLの二重蒸留水を加えて、1x改質タイローデ溶液を作ります。L-グルタチオンの3.07gをフラスコに還元溶解する。37°水浴中にフラスコを置きます。溶液が37°Cに達したら、NaOHを使用してpHを7.39に増やします。pHを調整した後、溶液を1,000mLの容積フラスコで体積に持ち込みます。真空ろ過システムを使用して溶液を滅菌する。 25mgの粉末にジメチルスルホキシド(DMSO)の855 μLを加えて、100 mMブレビスタチン原液を作ります。アリクォートは20°L刻みで出て、-80°Cの冷凍庫で最大6ヶ月間保存します。 ウシ血清アルブミン(BSA)の2gとアリクォートブレブスタチンストックの1バイアルを1x KHB-HBの100 mLに添加して停止緩衝液を作り、真空濾過システムを用いて溶液を滅菌する。 5 mL の胎児ウシ血清とアリクォートされたブレビスタチンストックの 1 バイアルを M199 HEPES の 95 mL に加えてめっきバッファーを作成します。真空ろ過システムを使用して溶液を滅菌する。 M199(25 mM HEPES)の396 mLにアリクォートブレビスタチンストックの1バイアルと4mlsペニシリンストレプトマイシンを1つの1バイアルを加えることによって筋細胞培養緩衝液を作る。真空ろ過システムを使用して溶液を滅菌する。 オートクレーブ2ペアのデュモンピンセット、アイリス湾曲ハサミ2組、ヘモスタット2組、整形手術鉗子1組、6つの黒編みシルク4-0縫合糸、外科ダブルスローノットとして使用するように配置された縫合糸、および4つの100 mLビーカー。 22 x 22 mm2ガラスカバースリップを滅菌します。まず、6つの井戸プレートの各ウェルにカバースリップを1枚置きます。その後、蓋を取り外した後、バイオセーフティキャビネットのUVランプをオンにし、カバーリップを1時間UVライトにさらします。 最初に氷の上にボトルを解凍することにより、作業ラミニンストックソリューションを作ります。1本のボトルの内容物を十分な冷たい無菌リン酸緩衝生理食塩水中(PBS)に加え、最終濃度0.04mg/mLに達します。アリクォートは1.3μLをオートクレーブ処理された1.5 mL遠心管に出す。-80°Cで保管してください。注:各チューブは、単一の6ウェルプレートのための十分なラミニンを持っています。複数の凍結解凍サイクルを避けてください。 最初に氷上の作業ラミニン溶液を解凍することによって、コーティング殺菌されたカバースリップ。P1000ピペットを使用して、ラミニンの200°Lを吸引する。カバースリップの一端に沿ってピペット先端をゆっくりとドラッグして、キャピラリーアクションが6つのウェルプレートへのカバースリップアタッチメントを容易にするために、微小な量のラミニンを引き出せるようにします。 次いで、カバースリップの中央に残ったラミニンを排出する。円形の動きで、ラミニン液滴をカバースリップ全体に広げます。37°Cのインキュベーターに少なくとも1時間、最大24時間を単離する前に置きます。 2. ランゲンドルフ装置の準備 注: このプロトコルで使用されるランゲンドルフ装置の個々のコンポーネントは、材料の表にリストされています。 循環水浴をオンにします。排煙が37°Cの温度になるように温度を設定します。注:溶液貯留部の高さを60cmに設定した場合、排液を37°Cにするには循環水産を41°Cに設定する必要があります。以前に報告されたプロトコルとは異なり、貯水池の高さを変更する必要はありません。 70%エタノールでランゲンドルフ装置をすすいで、続いてオートクレーブ二重蒸留水で2本のリンスを行います。すすがった後、貯蔵所をKHB-HBで満たし、100%酸素で酸素化します。 酸素化されたKHB-HBが最初に100 mLビーカーに流れるようにしてシステムをプライムします。50 mLの溶液がビーカーに流れたら、3ウェイストップコック位置を切り替えてKHB-HB貯留部からの流れを止めます。ビーカーから50mLの酸素化KHB-HBをコラゲナーゼ貯蔵所に注ぎます。 KHB-HBは、コラゲナーゼ貯留層に5mLが残るまで消化貯蔵所から排出します。コラゲナーゼ貯蔵所をプライミングしながら、ラインがドガを可能にするために、貯水池の間で3ウェイストップコックを繰り返し切り替えます。システムがプライミングされた後、加熱コイルの上にある脱気トラップを使用して、残りの空気がシステムを終了できるようにします。 コラゲアゲネアゲ液を作ります。ラットの場合、100mgのII型コラゲナーゼ、100mLの酸素化KHB-HB、およびブレビステインストックの2バイアルを組み合わせたもの。マウスの場合は、100mgのII型コラゲナーゼ、40mLの酸素化KHB-HB、およびブレビステインストックの2バイアルを組み合わせる。一度混合すると、溶液は1時間安定でなければなりません。注:筋細胞の生存率は、II型コラゲターゼロットによって異なる場合があります。コラゲラゲアゼサンプリングプログラムを利用して、バルクオーダーの前に多くのテストを行います。 3. 筋細胞分離 ヘパリン1,000Uで動物を注入します。5分待ちます。注:任意の年齢のマウスとラットを使用することができます。しかしながら、一般に、動物は古い以上の疾患を有し、筋細胞収率が低いほど低い。 ペントバルビタール混合物(150mg/kg腹腔内)で動物を安楽死させる前に、オープンドロップ法(500cc体積あたり1ccのアイソフルラン)を使用してイソフルランで最初に麻酔することによって動物を犠牲にします。 最初にxiphoidプロセスの上に毛皮をつかんで心臓を急速に励起する。虹彩はさみで、xiphoidプロセスのすぐ下に小さな切開を行い、毛皮を皮膚を露出させる頭部に向かって上向きに引っ張ります。 キシホイドプロセスをつかみ、胸腔を露出する横隔膜をカットします。トラップドア切開を行い、胸骨を止め、上行大弦波の上の心臓を切除し、冷たいKHB-HBに置くために湾曲した鉗子を使用します。 ステレオ顕微鏡と5番目の鉗子を使用して心臓をカニューレします。心臓が水没し、塞栓を防ぐために切除前にカニューレがプライミングされていることを確認してください。カニューレの先端を心室に約1mm上に可視化してカニューレの適切な位置を確認する。注:カノレーション時間が速いほど、筋細胞の収率が良くなります。 ランゲンドルフのストップコックを回転させてKHB-HBの流れを開始します。カニューレをランゲンドルフに接続します。心臓を5分間熟読しなさい。注:灌流は重力ベースのシステムによって供給されるため、心臓を通る流れは冠状動脈コンプライアンスの機能となります。 KHB-HB貯留部から消化バッファー貯蔵所への灌流を切り替える。消化バッファーが心臓に到達したら、タイマーを設定します (マウスの場合は 5 分、ラットの場合は 15 分)。滅菌100mLビーカーで含まれるのを必ず回収してください。消化時間が経過するまで、必要に応じて消化バッファー貯蔵所を含み、浸透液を補充します。 消化後、心臓のチャンバーを鉗子で分離し、虹彩はさみ、無菌の100 mLビーカーでシーブをする。各チャンバーを6つの井戸板の別々の井戸に入れます。各ウェルにコラゲラーゼ溶液を5mL注ぎます。 すぐにはさみを使用して心臓組織のミンチを開始します。組織チャンクは約1mm3でなければなりません。滅菌転写ピペットを使用して、ひき肉の心臓組織を穏やかにトリチュレートします。ソリューションは曇りになるはずです。 組織の塊が白く羽状になったら、反転顕微鏡で細胞を調べます。生存細胞の数が80%を超える場合は、100μmの細胞ストレーナーを用いて細胞を50mL円錐管に歪化する。心臓の部屋ごとに異なるチューブとストレーナーを使用してください。 生存細胞の数が80%未満の場合は、カニューレにかかった時間を確認してください。カンナレーション時間が5分を超える場合は、別の心臓を試してみてください。そうでない場合は、アッセイ新しいコラゲアゲ過多は、コラゲアゲ様サンプリングプログラムを介してロット。 215 x gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。ペレットはコンパクトで、緩んではいけないようにしてください。ペレットが緩んでいる場合、調製物には多くの死細胞が含まれる。組織培養フードで、停止緩衝液のペレットを10mLで再中断する。 215 x gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。ペレットはコンパクトで、緩んではいけないようにしてください。ペレットが緩んでいる場合、調製物には多くの死細胞が含まれる。 5 mL のめっきバッファーで細胞を再中断します。セル数を実行します。めっきバッファーのミリリットルを調整して、mLあたり2 x 104細胞の最終的な筋細胞濃度に達します。 ラミニンコーティングされたカバーリップをインキュベーターから取り外します。ラミニン液滴を吸引する。 各カバースリップ上の筋細胞懸濁液のプレート200μL。37°Cのインキュベーター(21%O2、5%CO2)を2時間取り付けて取り付けを許可します。2時間後、未結合細胞を吸引し、2mLの培養媒を加え、最大4日間培養した。 4. ふらは-2 染料の積み込み 2 mMフラ-2アセトキシメチルエステル(フラ-2 AM)の原液を作り、25μLのDMSOを50μgのフラ2 AM粉末(1バイアル)に加えて作ります。アリコートを6μLアリコートにアウト。フラ-2 AMのアリコートを1個取り、めっき培地を6mLに加えます。混ぜる渦。 インキュベーターから筋細胞の6つのウェルプレートを取り除きます。吸引メディア。各ウェルに1 mLのフラ2メディア混合物を加えます。ホイルでプレートを覆い、プレートを室温に残し、15分間待ちます。 吸引フラ2メディア混合物を吸引し、各井戸にタイローデの溶液の1 mLを追加します。ホイルで覆う。イメージングする前に色素の洗い流しを可能にするために、室温で20分間待ちます。 5. フルオ4染料ローディング 1.82 mM fluo-4 アセトキシメチルエステル(fluo-4 AM)の原液を、25μLのDMSOを50μgのフルオ4 AMパウダー(1バイアル)に加えて作ります。アリコートを8.333μLアリコートにアウト。Fluo-4 AMストックのアリコートを1個取り、めっき培地を6mLに加えます。混ぜる渦。 インキュベーターから筋細胞の6つのウェルプレートを取り除きます。吸引メディア。各ウェルにfluo-4 AMメディア混合物の1 mLを追加します。ホイルでプレートを覆い、プレートを室温に残し、15分間待ちます。 吸引フルオ-4 AMメディア混合物を吸引し、各井戸にタイローデ溶液の1 mLを追加します。ホイルで覆う。イメージングする前に色素の洗い流しを可能にするために、室温で20分間待ちます。 6. 膜電位染料のローディング 膜電位キットからコンポーネント A とコンポーネント B を取り外します。15 mL円錐管で、成分Bの50μLと5μLの成分A.ボルテックスを組み合わせて混合します。電圧染料混合物を含む15 mL円錐管に10mLのめっき媒体を加えます。混ぜる渦。 インキュベーターから筋細胞の6つのウェルプレートを取り除きます。メディアを吸引する。膜電位色素混合物の800°Lを各ウェルに加えます。ホイルでプレートを覆い、プレートを室温に残し、15分間待ちます。 吸引染料媒体混合物を加え、各ウェルに1mLの変性タイローデ溶液を加える。ホイルで覆う。 7. フォトメトリーと充電結合デバイスの記録 顕微鏡、アークランプ、ハイパースイッチ、蛍光インターフェースシステム、ミオカム電源、電界刺激装置、コンピュータの順に装置の電源を入れます。 励起/放出フィルタセットがイメージング染料に適していることを確認します。注:Fura-2は340 nmと380 nmの光で励起されます。それは光の510 nmで発する。Fluo-4と電圧膜色素は485nmの光で励起され、520nmの光で放出されます。 真空をオンにし、ホースクランプを完全に開き、マニホールドに使用されている各60 mLシリンジを穏やかに突き刺すことによって、システムをプライムします。カルシウムの記録のためにタイロードの溶液を使用します。電圧記録の場合は、変更されたタイローデの溶液を使用します。 ヒーターをオンにし、灌流チューブのローラークランプを調整して流れを設定します。36 ± 1 °Cで録音を行います。 取得ソフトウェアを開きます。正しいイメージング色素のパラメータが設定されていることを確認します。 暗闇の中で、6つの井戸プレートからホイルを取り出し、ペーシングチャンバーにカバースリップを置きます。このステップでは、刺激装置がオフになっていることを確認します。10倍の目的を使用して筋細胞に焦点を当てます。 焦点が合うと、1Hzで刺激する場でペーシングを開始し、0.2V.1ペーシングが得られるまで徐々に電圧を上げます。次に、しきい値に達するまで電圧を上げます。メモ:励起収縮カップリングは温度に依存するため、記録する前に細胞が15分間浸透していることを確認してください。これにより、筋細胞は室温から37°Cに戻るショックから回復し、ゆるやかに取り付けられた細胞を浮かび上がらすことができる。 10 倍の目標から 40 倍の目標に切り替えます。1:1 ペーシングに従うセルに焦点を当てます。1 つのセルだけが視野に入るように、プラスチックの色合いを調整します。 ソフトウェアを使用して、適切に定義されたサルコメアに対象の領域ボックスを配置します。励起光を開始するために、集録ソフトウェアを起動します。ニュートラル密度フィルタを使用して、それに応じて強度設定を調整し、適切な SNR を得る。