Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Case Western Reserve University genehmigt. 1. Vorbereitung von Lösungen, Instrumenten und Coverlips HINWEIS: 1x Lösungen können bis zu einem Monat verwendet werden. 10x Krebs-Henseleit Puffer HEPES Puffer ohne Kalzium (KHB-HB) durch Zugabe von 68,96 g NaCl, 3,57 g KCl, 59,58 g HEPES, 2,18 g K2HPO4, 3,08 g MgSO4 und 19,82 g Glukose bis 800 ml doppelt destilliertes Wasser in einem 1.000 ml Kolben. Nachdem der Inhalt vollständig aufgelöst ist, bringen Sie bis zu Volumen in einem 1.000 ml Volumetruhe.HINWEIS: Die traditionelle Krebs Henseleit-Lösung verwendet Natriumbicarbonat als Puffer und die Lösung in diesem Protokoll verwendet Krebs Henseleit-Lösung mit HEPES-Puffer. Die Lösung ist für 6 Monate stabil, wenn sie steril gefiltert wird. Machen Sie 10x Tyrodes Lösung durch Zugabe von 86,51 g NaCl, 0,552 g NaH2PO4, 2,03 g MgCl2, 9,91 g Glukose, 4,03 g KCl, 2,65 g CaCl2und 35,76 g HEPES bis 800 ml doppeldestilliertem Wasser in einem 1000 mLKolben. Nachdem der Inhalt vollständig aufgelöst ist, bringen Sie bis zu Volumen in einem 1000 ml Volumetruhe.HINWEIS: Die Lösung ist 6 Monate lang stabil, wenn sie steril gefiltert wird. Machen Sie 1x KHB-HB, indem Sie 100 ml des 10x Lagerbestands ausmessen und 875 ml doppelt destilliertes Wasser in einem 1.000 ml Kolben hinzufügen. Kolben in 37 °C Wasserbad legen. Sobald die Lösung 37 °C erreicht hat, verwenden Sie NaOH, um den pH-Wert auf 7,39 zu erhöhen. Nach der Einstellung des pH-Werts die Lösung in einem 1000 ml Volumetruhekolben aufbringen. Sterile Filter die Lösung mit einem Vakuumfiltrationssystem. Machen Sie 1x Tyrodes Lösung, indem Sie 100 ml des 10-fachen Lagerbestands messen und 875 ml doppelt destilliertes Wasser in einem 1.000 ml-Kolben hinzufügen. Kolben in 37 °C Wasserbad legen. Sobald die Lösung 37 °C erreicht hat, verwenden Sie NaOH, um den pH-Wert auf 7,39 zu erhöhen. Nach der Einstellung des pH-Werts die Lösung in einem 1.000 ml Volumetruhekolben aufbringen. Sterilfilter mit Vakuumfiltrationssystem. Machen Sie 1x modifizierte Tyrodes Lösung, indem Sie 100 ml des 10x-Lagers ausmessen und 875 ml doppelt destilliertes Wasser in einem 1.000 ml-Kolben hinzufügen. 3,07 g L-Glutathion im Kolben reduziert auflösen. Kolben in 37 °C Wasserbad legen. Sobald die Lösung 37 °C erreicht hat, verwenden Sie NaOH, um den pH-Wert auf 7,39 zu erhöhen. Nach der Einstellung des pH-Werts die Lösung in einem 1.000 ml Volumetruhekolben aufbringen. Sterile Filter die Lösung mit einem Vakuumfiltrationssystem. Machen Sie 100 mM Blebbistatin-Stammlösung, indem Sie 855 l Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 25 mg Pulver hinzufügen. Aliquot in 20 L-Schritten heraus und bis zu sechs Monate in einem Gefrierschrank von -80 °C lagern. Machen Sie den Stopppuffer durch Zugabe von 2 g Rinderserumalbumin (BSA) und 1 Durchstechflasche mit aliquotedem Blebbistatin-Bestand zu 100 ml 1x KHB-HB und sterilen Filter der Lösung mit einem Vakuumfiltrationssystem. Herstellung eines Beschichtungspuffers durch Zugabe von 5 ml fetalem Rinderserum und 1 Durchstechflasche des aliquotedn Blebbistatin-Bestands zu 95 ml M199 HEPES. Sterile Filter die Lösung mit einem Vakuumfiltrationssystem. Machen Sie Myozytenkulturpuffer, indem Sie eine Durchstechflasche des aliquotedn Blebbistatin-Bestands und 4 mls Penicillin-Streptomycin zu 396 ml M199 (25 mM HEPES) hinzufügen. Sterile Filter die Lösung mit einem Vakuumfiltrationssystem. Autoklav 2 Paar Dumont Pinzette, 2 Paare von Iris gekrümmte Schere, 2 Hämostate, ein Paar plastische Chirurgie Zangen, 6 schwarze geflochtene Seide 4-0 Nähte angeordnet, um als chirurgische doppel-Wurf Knoten verwendet werden, und vier 100 ml Becher. Sterilisieren 22 x 22 mm2 Glasabdeckungen. Legen Sie zunächst einen einzigen Coverslip in jeden Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Danach, mit dem Deckel entfernt, schalten Sie die UV-Lampe des Biosicherheitsschranks ein und setzen Sie die Abdeckungen für 1 h UV-Licht aus. Machen Sie funktionierende Laminin-Lager-Lösung, indem Sie zuerst die Flasche auf Eis auftauen. Fügen Sie den Inhalt einer Flasche zu genügend kaltsteriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) hinzu, um eine Endkonzentration von 0,04 mg/ml zu erreichen. Aliquot aus 1,3 l in autoklavierte 1,5 ml Zentrifugenrohre. Bei -80 °C lagern.HINWEIS: Jedes Rohr hat genug Laminin für eine einzelne sechs Well-Platte. Vermeiden Sie mehrere Frost-Tau-Zyklen. Mantel sterilisierter Deckelschlupf, indem Sie zuerst die arbeitende Lamininlösung auf Eis auftauen. Mit einer P1000 Pipette, aspirieren 200 l Laminin. Ziehen Sie die Pipettenspitze vorsichtig entlang einer Kante des Coverslip, damit die Kapillarwirkung eine winzige Menge Laminin herausziehen kann, um die Deckslipbefestigung an der sechs Brunnenplatte zu erleichtern. Dann vertreiben Sie das restliche Laminin in der Mitte des Deckels. In einer kreisförmigen Bewegung das Laminintröpfchen über den Deckelschieben verteilen. In einem 37 °C-Inkubator mindestens 1 h und bis zu 24 h vor der Isolierung platzieren. 2. Vorbereitung des Langendorff-Apparats HINWEIS: Die einzelnen Komponenten des Langendorff-Geräts, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Schalten Sie das zirkulierende Wasserbad ein. Stellen Sie die Temperatur so ein, dass Perfusate eine Temperatur von 37 °C hat.HINWEIS: Bei einer Höhe von 60 cm müssen die Lösungsbehälter auf 41 °C eingestellt werden, damit die Perfusate 37 °C beträgt. Im Gegensatz zu zuvor gemeldeten Protokollen muss die Höhe des Reservoirs nicht geändert werden. Spülen Sie das Langendorff-Gerät mit 70% Ethanol, gefolgt von zwei Spülungen mit autoklavierten doppeldestilliertem Wasser. Nach dem Spülen das Reservoir mit KHB-HB füllen und mit 100% Sauerstoff sauerstoffhaltigen Sauerstoff füllen. Primieren Sie das System, indem Sie sauerstoffhaltigen KHB-HB zuerst in einen 100 ml Becher fließen lassen. Sobald 50 ml Lösung in das Becherglas geflossen sind, schalten Sie die 3-Wege-Stop-Hahn-Position, um den Fluss aus dem KHB-HB-Reservoir zu stoppen. 50 ml mit Sauerstoff versorgtes KHB-HB aus dem Becherinker in das Kollagenasereservoir gießen. Lassen Sie den KHB-HB aus dem Verdauungsreservoir abtropfen, bis 5 ml im Kollagenase-Reservoir verbleiben. Während der Grundierung Kollagenase Reservoir, schalten Sie die 3-Wege-Stopp-Hahn wiederholt zwischen Reservoirs, damit die Linien zu entgasen. Nachdem das System grundiert ist, denken Sie daran, die Entgasungsfalle auf der Oberseite der Heizspule zu verwenden, damit die verbleibende Luft das System verlassen kann. Machen Sie die Kollagenase-Lösung. Für Ratten kombinieren 100 mg Typ II Kollagenase, 100 ml mit Sauerstoff KHB-HB und 2 Durchstechflaschen des Blebbistain-Bestands. Für Mäuse kombinieren Sie 100 mg Kollagennase typ II, 40 ml mit Sauerstoff gefülltem KHB-HB und 2 Durchstechflaschen des Blebbistain-Bestands. Einmal gemischt, sollte die Lösung für 1 h stabil sein.HINWEIS: Die Myozytenlebensfähigkeit kann zwischen Denkolagenase-Lotsen typ II variieren. Nutzen Sie ein Collagenase-Sampling-Programm, um vor der Massenbestellung viel zu testen. 3. Myozytenisolation Injizieren Sie das Tier mit 1.000 U Heparin. Warten Sie 5 min.HINWEIS: Mäuse und Ratten jeden Alters können verwendet werden. Im Allgemeinen jedoch, je älter oder mehr erkrankt das Tier, desto niedriger die Myozytenausbeute. Opfern Sie das Tier, indem Sie es zuerst mit Isofluran mit der Open-Drop-Methode (1 cc Isofluran pro 500 ccm Volumen) anbemaßen, bevor Sie das Tier mit einer Pentobarbitalmischung einschläfern (150 mg/kg intraperitoneal). Schnell verbrauchen das Herz, indem Sie zuerst das Fell über dem xiphoiden Prozess greifen. Mit der Irisschere einen kleinen Schnitt direkt unterhalb des xiphoiden Prozesses machen und das Fell nach oben zum Kopf ziehen, der die Haut freilegt. Schnappen Sie sich den Xiphoid-Prozess und schneiden Sie das Zwerchfell, das die Brusthöhle freilegt. Machen Sie einen Falltürschnitt, ziehen Sie das Brustbein mit einem Hämostat zurück, und verwenden Sie die gekrümmten Zangen, um das Herz über der aufsteigenden Aorta zu verbrauchen und in kalteKHB-HB zu platzieren. Kanülieren Sie das Herz mit einem Stereomikroskop und der Nummer 5 Zangen. Stellen Sie sicher, dass das Herz untergetaucht ist und die Kanüle vor der Herzexzision grundiert wurde, um Emboli zu verhindern. Bestätigen Sie die richtige Positionierung der Kanüle, indem Sie die Spitze der Kanüle ca. 1 mm über dem Aorteneinsatz in den Ventrikel visualisieren.ANMERKUNG: Je schneller die Cannulationszeit, desto besser die Myozytenausbeute. Starten Sie den Fluss von KHB-HB, indem Sie den Stopphahn auf dem Langendorff drehen. Verbinden Sie die Kanüle mit dem Langendorff. Durchdringen Sie das Herz für 5 min.HINWEIS: Da die Perfusion von einem schwerkraftbasierten System geliefert wird, wird der Fluss durch das Herz eine Funktion der koronaren Arterienkonformität sein. Wechseln Sie die Perfusion vom KHB-HB-Reservoir zum Verdauungspufferreservoir. Sobald der Verdauungspuffer das Herz erreicht hat, stellen Sie einen Timer ein (5 min für die Maus oder 15 min für Ratte). Achten Sie darauf, die Perfusate in einem sterilen 100 ml Becher zu sammeln. Füllen Sie den Verdauungspufferbehälter nach Bedarf mit dem Perfusate nach, bis die Verdauungszeit abgelaufen ist. Nach der Verdauung die Herzkammern mit Zangen und der Irisschere in einem sterilen 100 ml Becher trennen. Legen Sie jede Kammer in einen separaten Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Gießen Sie 5 ml Kollagennase-Lösung in jeden Brunnen. Sofort beginnen, das Herzgewebe mit einer Schere zu schneiden. Gewebestücke sollten ca. 1 mm3betragen. Mit sterilen Transferpipetten das gehackte Herzgewebe vorsichtig trituieren. Die Lösung sollte trüb werden. Sobald die Gewebestücke weiß und gefiedert werden, untersuchen Sie die Zellen mit einem invertierten Mikroskop. Wenn die Anzahl der lebensfähigen Zellen größer als 80 % ist, sollten Sie die Zellen mit einem 100 m Zellsieb in ein 50 ml konisches Rohr legen. Verwenden Sie für jede Kammer des Herzens eine andere Röhre und ein anderes Sieb. Wenn die Anzahl der lebensfähigen Zellen weniger als 80 % beträgt, überprüfen Sie die Zeit, die zum Cannulaten erforderlich war. Wenn die Cannulationszeit über 5 min beträgt, versuchen Sie es mit einem anderen Herzen. Wenn nicht, assay neue Kollagenase viel durch die Kollagenase Sampling-Programm. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 215 x g für 2 min. Das Pellet sollte kompakt und nicht locker sein. Wenn das Pellet lose ist, enthält das Präparat viele abgestorbene Zellen. In einer Gewebekulturhaube das Pellet in 10 ml Stopppuffer wieder aufsetzen. Pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 215 x g für 2 min. Das Pellet sollte kompakt und nicht locker sein. Wenn das Pellet lose ist, enthält das Präparat viele abgestorbene Zellen. Setzen Sie die Zellen in 5 ml Beschichtungspuffer wieder aus. Führen Sie eine Zellenanzahl aus. Passen Sie die Milliliter des Beschichtungspuffers an, um eine endgültige Myozytenkonzentration von 2 x 104 Zellen pro ml zu erreichen. Entfernen Sie die lamininbeschichteten Abdeckungen aus dem Inkubator. Aspirieren Sie das Laminintröpfchen. Platte 200 L Myozytenaufhängung auf jedem Deckel. In einen 37 °C-Inkubator (21% O2, 5% CO2) für 2 h legen, um eine Befestigung zu ermöglichen. Nach 2 h, aspirieren Sie die nicht angeschlossenen Zellen, fügen Sie 2 ml Kulturmedien und Kultur für bis zu 4 Tage hinzu. 4. Fura-2 Farbstoff Beladung Machen Sie eine 2 mM Fura-2 Acetoxymethylester (fura-2 AM) Stofflösung, indem Sie 25 l DMSO zu 50 g Fura-2 AM Pulver (1 Durchstechflasche) hinzufügen. Aliquot out in 6 L aliquots. Nehmen Sie 1 Aliquot von fura-2 AM und fügen Sie zu 6 ml Beschichtungsmedium hinzu. Wirbel zu mischen. Entfernen Sie 1 sechs Well-Platte von Myozyten aus dem Inkubator. Aspirat-Medien. Fügen Sie 1 ml Fura-2-Medienmischung zu jedem Brunnen hinzu. Deckplatte mit Folie abdecken, die Platte bei Raumtemperatur lassen und 15 min warten. Aspirieren Fura-2 Medienmischung und fügen Sie 1 ml Tyrodes Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Abdeckung mit Folie. Warten Sie 20 min bei Raumtemperatur, um vor der Bildgebung farbstoffauswaschen zu können. 5. Fluo-4 Farbstoff Beladung Machen Sie eine 1,82 mM Fluo-4-Acetoxymethylester (fluo-4 AM) Stofflösung, indem Sie 25 l DMSO zu 50 g Fluo-4-AM-Pulver (1 Durchstechflasche) hinzufügen. Aliquot out in 8.333 ‘L aliquots. Nehmen Sie 1 Aliquot von Fluo-4 AM Vorrat und fügen Sie zu 6 ml Beschichtungsmedium hinzu. Wirbel zu mischen. Entfernen Sie 1 sechs Well-Platte von Myozyten aus dem Inkubator. Aspirat-Medien. Fügen Sie 1 ml Fluo-4 AM Medienmischung zu jedem Brunnen hinzu. Deckplatte mit Folie abdecken, die Platte bei Raumtemperatur lassen und 15 min warten. Aspirieren Fluo-4 AM Medienmischung und fügen Sie 1 ml Tyrodes Lösung zu jedem Brunnen hinzu. Abdeckung mit Folie. Warten Sie 20 min bei Raumtemperatur, um vor der Bildgebung farbstoffauswaschen zu können. 6. Membranpotenzial Farbstoff-Laden Entfernen Sie Komponente A und Komponente B aus dem Membranpotential-Kit. In einem 15 ml konischen Rohr 50 l Der Komponente B und 5 l der Komponente A. Vortex zum Mischen kombinieren. Fügen Sie dem 15 ml konischen Rohr, das das Spannungsfarbstoffgemisch enthält, 10 ml Beschichtungsmedien hinzu. Wirbel zu mischen. Entfernen Sie 1 sechs Well-Platte von Myozyten aus dem Inkubator. Aspirieren Sie die Medien. Fügen Sie jedem Brunnen 800 l des Membranpotential-Farbstoffgemisches hinzu. Deckplatte mit Folie abdecken, die Platte bei Raumtemperatur lassen und 15 min warten. Beschumen Sie die Medienmischung und fügen Sie jedem Brunnen 1 ml modifizierte Tyrodes Lösung hinzu. Abdeckung mit Folie. 7. Photometrie und Ladegekoppelte Geräteaufzeichnungen Schalten Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge ein: Mikroskop, Lichtbogenlampe, Hyperschalter, Fluoreszenzschnittstellensystem, Myocam-Netzteil, Feldstimulator und Computer. Stellen Sie sicher, dass die Anregungs-/Emissionsfiltersätze für den Bildfarber geeignet sind.HINWEIS: Fura-2 ist bei 340 nm und 380 nm Licht aufgeregt. Es emittiert bei 510 nm Licht. Fluo-4 und der Spannungsmembranfarbstoff werden bei 485 nm Licht angeregt und emittieren bei 520 nm Licht. Primieren Sie das System, indem Sie das Vakuum einschalten, die Schlauchklemme vollständig öffnen und jede 60 ml Spritze, die im Verteiler verwendet wird, sanft eintauchen. Für Kalziumaufnahmen verwenden Sie Die Tyrodes Lösung. Für Spannungsaufzeichnungen verwenden Sie modifizierte Tyrodes Lösung. Heizung einschalten und durch die Einstellung der Walzenklemme an den Perfusionsschläuchen einstellen. Machen Sie Aufnahmen bei 36 °C. Öffnen Sie die Erfassungssoftware. Stellen Sie sicher, dass die Parameter für den richtigen Bildfarbe färben. Im Dunkeln die Folie von der sechs Brunnenplatte entfernen und einen Deckelschlupf in die Schrittkammer legen. Stellen Sie sicher, dass der Stimulator in diesem Schritt ausgeschaltet ist. Konzentrieren Sie sich auf die Myozyten mit dem 10x Objektiv. Einmal im Fokus, beginnen Schritt durch Feld stimulierenbeit bei 1 Hz, 0,2 V. Schrittweise erhöhen die Spannung, bis 1:1 Schritt erreicht wird. Erhöhen Sie dann die Spannung, bis 1,5-fach der Schwellenwert erreicht ist.HINWEIS: Da die Anregungs-Kontraktionskopplung temperaturabhängig ist, stellen Sie sicher, dass die Zellen 15 min lang durchdrungen wurden, bevor Sie aufgezeichnet werden. Dadurch können sich Myozyten von dem Schock erholen, von der Raumtemperatur zurück auf 37 °C zu gehen, sowie lose befestigte Zellen, um wegzuschwimmen. Wechseln Sie vom 10x-Ziel zum 40x-Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf eine Zelle, die einem 1:1-Tempo folgt. Passen Sie die Kunststofftöne so an, dass sich nur eine Zelle im Sichtfeld befindet. Mit der Software platzieren Sie den Interessenbereich auf klar definierten Sarcomeren. Starten Sie die Erfassungssoftware, um das Anregungslicht zu initiieren. Passen Sie die Intensitätseinstellung mithilfe der Neutraldichtefilter entsprechend an, um eine ausreichende SNR zu erhalten.