我们介绍了分离鼠肌细胞的方法,以及如何使用荧光光度测量与同时进行数字细胞几何测量,同时获得电压或钙痕迹。
分离成人心肌细胞的能力使研究人员能够在单细胞水平上研究各种心脏病变。虽然钙敏感染料的进步使得单细胞钙动力学具有强大的光学记录,但强大的跨膜光电压信号的记录仍然很困难。可以说,这是因为传统电位染料的低单噪声比、光毒性和光漂白。因此,单单元电压测量长期以来一直局限于贴片钳技术,而该技术虽然是金本位,但技术要求高,吞吐量低。然而,随着新型电位染料的发展,只需很少或没有光毒性和光漂白,就可以获得对电压变化的较大、快速的光响应。该协议详细介绍了如何分离可用于细胞缩短、钙和光电压测量的成年肌细胞。具体来说,该协议描述了如何使用比例钙染料、单激励钙染料和单激励电压染料。这种方法可用于评估各种化学制剂的心肌毒性和心律失常性。虽然光毒性在单细胞水平上仍然是一个问题,但讨论如何减少光毒性。
为了研究心脏在健康和病理状态,它往往是有用的检查表型在单细胞水平。虽然科学的进步使得单细胞钙动力学的可靠测量得以进行,但单细胞光电压测量仍然很少。可以说,这是因为低信噪比(SNR),光毒性,以及传统电位染料2,3的光漂白。尽管如此,孤立的肌细胞光学作用电位已经获得了2,3,4。此外,随着电压敏感染料的化学和物理学的进步,SNR 提高了5。较新的膜电位探针(材料表)对亚毫秒内膜电位的变化作出反应,其荧光反应范围约为每100 mV25%。此外,膜电位试剂盒的激发/发射(例如,FluoVolt;材料表)该协议中使用的标准荧光素等西洋酸酯 (FITC) 或绿色荧光蛋白 (GFP) 设置6。
FITC和GFP激励/发射光谱与氟-4钙结合光谱7重叠。荧光光度测量与数字细胞几何测量同步采集传统上一直用于同时采集钙和细胞缩短测量8。该协议详细介绍了如何分离肌细胞,以及如何使用标准的FITC设置记录钙或电压信号。此外,它还描述了如何使用成像工作站上的激励/发射过滤器中的简单开关,使用公制钙染料 fura-2 的比例获得钙和缩短测量。与荧光-4相比,fura-2对钙的亲和力更高,对光漂白9具有相对的抵抗力。因此,使用单个工作站,该协议允许单独彻底检查肌细胞激发-收缩耦合。
能够分离心细胞是一种强大的方法,可用于了解心脏生理学、病理学和毒理学。在上述协议中,我们描述了一种利用恒定重力压力兰根多夫装置获得单心肌细胞的方法。之后,利用荧光光度测定系统,描述了如何同时获得钙和缩短或电压和缩短痕迹。
由于钙染料之间的动力学不同,必须注意选择哪种染料。对于此协议,使用的 fura-2 和荧光-4 均采用 AM 酯设计,需要洗涤步骤,以便细胞内酯酸时间将 AM 组切下并捕获细胞中的染料。虽然Fura-2和氟-4都被认为是高亲和力钙染料,但Fura-2的Kd为145 nM,而荧光-49为345 nM。此外,fura-2 是比率的。因此,它可以用来量化细胞内钙水平9,12。另一方面是单波钙探针。4号是单波钙探针。使用荧光-4的优点是它产生更亮的荧光信号。无论使用哪种钙染料,与钙染料相比,膜电压探头的SNR较低。
如图4和图5所示,与钙痕量相比,电压痕迹的振幅较小。使用软件的数字跟踪滤波,可以增加SNR和量化数据(图4和图7)。一旦量化,钙瞬变和光学AD都表现出恢复性,以更快的起搏频率缩短其持续时间(图2,图3,图6和图7)。在更快的起搏周期中,需要更短的 AD,以便在隔膜期间留出足够的时间进行心室填充。这种现象的变化被认为是表明阿瑞特米亚斯13,14,15,16的风险增加。虽然APD的改变可以由疾病引起,但它们也可能由化学物质引起。如图7所示,当主要的鼠酸钾电流(I到)被阻塞时,光学APD变长。
然而,正如之前用电压敏感染料报道的那样,光强度和持续时间可以改变APD2,5,17。这被认为是反应性氧化物种(ROS)5产生的结果。此前已经表明,在记录溶液中加入抗氧化剂可以防止电压敏感染料细胞毒性5。因此,我们在Tyrode的溶液中添加了抗氧化剂L-谷胱甘肽(10 mM)。图8中所示是 1 Hz 起搏时获得的 20 s 录制的最后 11 s。如红色箭头所示,APD 的更改直到 15 s 进入录制;因此,虽然改良的Tyrode溶液不能防止光毒性,但它大大延缓了光毒性。使用经过改进的 Tyrode 解决方案,使用低光强度设置并将录制时间保持在 5 s 以下,可以避免 APD 中任何染料引起的更改。这一点很重要,因为如果不注意避免光毒性,数据可能被误解为在脱极化后导致早期或延迟。除了限制蓝光照射外,还可以采取其他预防措施,以防止对数据的误解。
第一种是只记录从细胞跟随一对一的起搏,并且休息的沙科梅长度大于或等于1.75μm。1.75 μm截止值取自戈登等人18的观察,即一旦沙科梅长度低于这个量,张力就会迅速下降。尽管如此,某些病理学可能会导致休息沙科梅长的显著改变。为了确保表型是真实的,而不是隔离的伪影,应采取以下故障排除方法。
如果肌细胞始终不遵循1:1起搏,沙棘长度低于1.75μm,重膜颤动,或无法生存的隔离,首先要检查的是它花了时间,以可以使心脏。罐期越长,产量越低。如果需要长时间的排泄时间,可以通过将心脏置于心电图溶液19来提高生存能力。然而,由于胶原酶是一种酶,特定批次的活性和特异性会随着时间而改变。如果整体收益率在保持良好收高时间的情况下逐渐恶化,则应对新手数进行测定。虽然我们的协议针对 5 s 录像进行了优化,但如果需要更长的电压曲线,则需要购买额外的中性密度滤波器。协议中描述的系统附带中性密度滤波器,可将透射光减少 37%、50%、75%、90% 和 95%。
总之,我们描述了一种方法,允许分离用于钙、电压和沙科梅雷缩短测量的成年鼠心室肌细胞。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢达娜·摩根斯坦仔细校对手稿。
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
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4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
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Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
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Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
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