Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Alle methoden en procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de Case Western Reserve University. 1. voorbereiding van oplossingen, instrumenten en Dekbonnen Opmerking: 1x-oplossingen kunnen maximaal een maand worden gebruikt. Maak 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer zonder calcium (KHB-HB) door toevoeging van 68,96 g NaCl, 3,57 g KCl, 59,58 g van HEPES, 2,18 g van K2HPO4, 3,08 g van MgSO4 en 19,82 g glucose tot 800 ml dubbel gedestilleerd water in een 1.000 ml kolf. Als de inhoud volledig is opgelost, breng dan tot het volume in een maatkolf van 1.000 mL.Opmerking: traditionele Krebs-Henseleit-oplossing maakt gebruik van natriumbicarbonaat als buffer en de oplossing in dit protocol maakt gebruik van Krebs-Henseleit-oplossing met HEPES-buffer. Oplossing is stabiel gedurende 6 maanden indien steriel gefilterd. Maak de oplossing van 10x Tyrode door 86,51 g NaCl, 0,552 g van NaH2po4, 2,03 g mgcl2, 9,91 g glucose, 4,03 g KCl, 2,65 g CACL2en 35,76 g Hepes toe te voegen aan 800 ml dubbel gedestilleerd water in een 1000 ml kolf. Als de inhoud volledig is opgelost, breng dan tot het volume in een maatkolf van 1000 mL.Opmerking: de oplossing is 6 maanden stabiel indien steriel gefilterd. Maak 1x KHB-HB door 100 mL van de 10x kolf te meten en toe te voegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1000 mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem. Maak 1x Tyrode oplossing door het meten van 100 mL van de 10x kolf en het toevoegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1.000 mL. Steriel filter met een vacuümfiltratie systeem. Breng 1x gemodificeerde Tyrode oplossing aan door 100 mL van de 10x kolf te meten en toe te voegen aan 875 mL dubbel gedestilleerd water in een maatkolf van 1.000 mL. Los 3,07 g L-glutathion op, verminderd in de kolf. Plaats de kolf in een waterbad van 37 °C. Zodra de oplossing 37 °C heeft bereikt, gebruikt u NaOH om de pH te verhogen naar 7,39. Breng na het afstellen van de pH oplossing op volume in een maatkolf van 1.000 mL. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem. Maak 100 mM blebbistatin voorraadoplossing door 855 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan 25 mg poeder. In stappen van 20 μL en bewaar in een vriezer van 80 °C gedurende maximaal zes maanden. Maak de stop buffer door 2 g bovine serumalbumine (BSA) en 1 injectieflacon met aliceen blebbistatine kolf toe te voegen tot 100 mL 1x KHB-HB en steriele filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem. Maak een plating buffer door 5 mL foetaal runderserum en 1 injectieflacon met het aliceen blebbistatin kolf toe te voegen aan 95 mL M199 HEPES. Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem. Maak de myocyten cultuur buffer door een 1 Injectieflacon van de aliciteerde blebbistatin kolf en 4 MLS penicillin-streptomycine toe te voegen aan 396 mL M199 (25 mM HEPES). Steriel filter de oplossing met behulp van een vacuümfiltratie systeem. Autoclaaf 2 paar Dumont pincet, 2 paar Iris gebogen schaar, 2 hemostatica, één paar plastische chirurgie pincet, 6 zwart gevlochten zijde 4-0 hechtingen gerangschikt om te worden gebruikt als een chirurgische dubbele-throw Knot, en 4 100 mL bekerglazen. Steriliseren 22 x 22 mm2 glazen dekstroken. Plaats eerst een enkele afdekplaat in elke put van een zes put. Nadat het deksel is verwijderd, zet u de UV-lamp van de bioveiligheid Cabinet aan en stelt u de afdek stroken bloot aan UV-licht gedurende 1 uur. Maak werken laminine Stock Solution door de fles eerst op ijs te ontdooien. Voeg inhoud van één fles toe aan voldoende koude steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om een eindconcentratie van 0,04 mg/mL te bereiken. Aliquot 1,3 μL in geautoclaveerd 1,5 mL centrifugebuizen. Bewaren bij-80 °C.Opmerking: elke buis heeft genoeg laminine voor een enkele zes goed plaat. Vermijd meerdere Vries ontdooien cycli. Mantel gesteriliseerde dekslip door eerst de werkende laminine oplossing op ijs te ontdooien. Zuig met behulp van een P1000 pipet 200 μL laminin. Sleep de pipetpunt voorzichtig langs een rand van de afdekplaat om capillaire actie uit te laten trekken van een minuscule hoeveelheid laminine om de afdek bevestiging aan de zes put te vergemakkelijken. Vervolgens verdrijven de resterende laminine in het midden van de dekslip. In een cirkelvormige beweging, verspreid de laminine druppel over de dekslip. Plaats in een incubator van 37 °C ten minste 1 uur en tot 24 uur vóór de isolatie. 2. bereiding van het Langendorff-apparaat Opmerking: de afzonderlijke onderdelen van het Langendorff-apparaat die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de lijst met materialen. Schakel het circulerende waterbad in. Stel de temperatuur in zodat perfusaat een temperatuur van 37 °C heeft.Opmerking: met de oplossings reservoirs die zijn ingesteld op een hoogte van 60 cm, moet de circulerende water geboorte worden ingesteld op 41 °c om de perfusaat 37 °c te hebben. In tegenstelling tot eerder gerapporteerde protocollen hoeft de hoogte van het reservoir niet te worden gewijzigd. Spoel het Langendorff-apparaat af met 70% ethanol, gevolgd door twee spoelen met dubbel gedestilleerd water. Na het spoelen vult u het reservoir met KHB-HB en oxygenaat met 100% zuurstof. Het systeem wordt primair door zuurstofrijk khb-HB in een bekerglas van 100 ml te laten stromen. Zodra 50 mL oplossing in het bekerglas is geploegd, schakelt u de 3-weg stop-Cock positie om de stroom van het KHB-HB reservoir te stoppen. Giet 50 ml zuurstofrijk khb-HB uit het bekerglas in het Collagenase reservoir. Laat de KHB-HB uit het spijsverterings reservoir afvloeien tot 5 mL in het Collagenase reservoir. Tijdens het priming Collagenase reservoir, schakel de 3-weg stop haan herhaaldelijk tussen reservoirs om de lijnen te Degas. Nadat het systeem is geprimeerd, vergeet niet om de ontgassings trap bovenop de verwarmings spoel te gebruiken, zodat eventuele resterende lucht het systeem kan verlaten. Maak de Collagenase-oplossing. Voor ratten combineren 100 mg type II Collagenase, 100 ml zuurstofrijk khb-HB, en 2 flacons van de blebbistain kolf. Voor muizen, combineer 100 mg type II Collagenase, 40 ml van zuurstofrijk khb-HB, en 2 flacons van de blebbistain kolf. Eenmaal gemengd, de oplossing moet stabiel zijn voor 1 h.Opmerking: de levensvatbaarheid van Myocyte kan variëren tussen type II Collagenase lots. Profiteer van een Collagenase-bemonsteringsprogramma om veel te testen voordat u in bulk bestelt. 3. Myocyte-isolatie Injecteer het dier met 1.000 U heparin. Wacht 5 min.Opmerking: muizen en ratten van elke leeftijd kunnen worden gebruikt. Echter, in het algemeen de oudere of meer zieke het dier, hoe lager de myocyten opbrengst. Offer het dier door eerst het anesthetiseren met Isofluraan met behulp van de open-drop-methode (1 CC van Isofluraan per 500 cc volume) voor euthanatering van het dier met een pentobarbital mengsel (150 mg/kg intraperitoneaal). Snel het hart van de accijns door eerst de vacht boven het xifoïde proces te grijpen. Met de Iris schaar, maak een kleine incisie onmiddellijk onder het xifoïde proces en trek de vacht naar boven naar het hoofd bloot de huid. Pak het xifoïde proces en snijd het diafragma bloot de thoracische holte. Maak een val deur incisie, trek het borstbeen terug met behulp van een hemostat, en gebruik de gebogen Tang te accijnzen het hart boven de stijgende aorta en plaats in koude KHB-HB. Cannulate het hart met behulp van een stereomicroscoop en nummer 5 Tang. Zorg ervoor dat het hart wordt ondergedompeld en de canule werd voor de hart excisie voorgevuld om emboli te voorkomen. Bevestig de juiste positionering van de canule door de punt van de canule ongeveer 1 mm boven de aorta-insertie in de ventrikel te visualiseren.Opmerking: hoe sneller de cannulatie tijd, hoe beter de myocyten opbrengst. Start de stroom van khb-HB door de kraantje op de Langendorff te draaien. Sluit de canule aan op de Langendorff. Parfuseer het hart gedurende 5 minuten.Opmerking: aangezien perfusie wordt geleverd door een op zwaartekracht gebaseerd systeem, zal de stroom door het hart een functie van coronaire arteriële compliance zijn. Schakel perfusie van het KHB-HB reservoir naar het verterings buffer reservoir. Zodra de digestie buffer het hart bereikt, stelt u een timer in (5 min voor muis of 15 min voor rat). Zorg ervoor dat u de perfusaat in een steriel 100 ml bekerglas verzamelt. Vul het verterings buffer reservoir zo nodig aan met de perfusaat totdat de verterings tijd is verstreken. Scheid na de spijsvertering de kamers van het hart met een tang en de Iris schaar in een steriel 100 mL bekerglas. Plaats elke kamer in een aparte put van een zes goed plaat. Giet 5 mL Collagenase-oplossing in elke put. Begin onmiddellijk met het hakken van het hartweefsel met een schaar. Weefsel brokken moeten ongeveer 1 mm3zijn. Gebruik de steriele Transfer pipetten om het fijngehakte hart voorzichtig te tritureren. De oplossing moet troebel worden. Zodra de weefsel brokken wit en vederlicht worden, onderzoekt u de cellen met een omgekeerde Microscoop. Als het aantal levensvatbare cellen groter is dan 80%, ga dan verder om de cellen in een conische buis van 50 mL te belasten met behulp van een celzeef van 100 μm. Gebruik een andere buis en zeef voor elke kamer van het hart. Als het aantal levensvatbare cellen kleiner is dan 80%, controleert u de tijd die het kostte om te cannuleren. Als de cannulatie tijd meer dan 5 minuten is, probeer dan een ander hart. Zo niet, test dan nieuwe Collagenase-lots via het Collagenase-bemonsteringsprogramma. Pellet de cellen door centrifugeren bij 215 x g gedurende 2 min. De pellet moet compact zijn en niet los. Als de pellet los zit, bevat het preparaat veel dode cellen. In een weefselkweek afzuigkap, respendeer de pellet in 10 mL stop buffer. Pellet de cellen door centrifugeren bij 215 x g gedurende 2 min. De pellet moet compact zijn en niet los. Als de pellet los zit, bevat het preparaat veel dode cellen. Respendeer de cellen in 5 mL plating buffer. Voer een aantal cellen uit. Pas de milliliter van de plating buffer aan om een uiteindelijke myocyten concentratie van 2 x 104 cellen per ml te bereiken. Verwijder de afdek stroken met laminin coating uit de incubator. Aspireren de laminine druppel. Plaat 200 μL myocyten suspensie op elke dekslip. Plaats in een incubator van 37 °C (21% O2,5% co2) voor 2 uur om bevestiging toe te staan. Na 2 h, aspireren de niet-aangehechte cellen, voeg 2 mL cultuur media, en cultuur voor maximaal 4 dagen. 4. Fura-2 kleurstof laden Maak een 2 mM Fura-2 acetoxymethyl Ester (Fura-2 AM) stockoplossing door toevoeging van 25 μL DMSO aan 50 μg Fura-2 AM poeder (1 injectieflacon). In 6 μL aliquots. Neem 1 aliquot Fura-2 AM en voeg toe aan 6 mL beplating medium. Vortex om te mengen. Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. Aspirate media. Voeg 1 mL Fura-2 media mengsel toe aan elk goed. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min. Aspirate Fura-2 media mengsel en voeg 1 mL Tyrode oplossing toe aan elke put. Afdekking met folie. Wacht 20 minuten bij kamertemperatuur om de kleurstof te laten wassen vóór de beeldvorming. 5. fluo-4 kleurstof laden Maak een 1,82 mM fluo-4 acetoxymethyl Ester (fluo-4 AM) stockoplossing door 25 μL DMSO toe te voegen aan 50 μg fluo-4 AM poeder (1 injectieflacon). In 8,333 μL aliquots. Neem 1 aliquot fluo-4 AM voorraad en voeg toe aan 6 mL beplating medium. Vortex om te mengen. Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. Aspirate media. Voeg 1 mL fluo-4 AM media mengsel toe aan elk goed. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min. Aspirate fluo-4 AM media mengsel en voeg 1 mL Tyrode oplossing aan elke put. Afdekking met folie. Wacht 20 minuten bij kamertemperatuur om de kleurstof te laten wassen vóór de beeldvorming. 6. membraanpotentiaal kleurstof belasting Verwijder component A en component B uit de membraanpotentiaal Kit. Combineer in een conische buis van 15 mL 50 μL van component B en 5 μL component A. Vortex om te mengen. Voeg 10 mL uitplatings media toe aan de conische buis van 15 mL die het voltage kleurstof mengsel bevat. Vortex om te mengen. Verwijder 1 6 goed plaat van myocyten uit de incubator. De media te aspireren. Voeg aan elk goed 800 μL van het membraanpotentiaal kleurstof mengsel toe. Afdekplaat met folie, laat de plaat bij kamertemperatuur en wacht 15 min. Aspirate Dye media mengsel en voeg 1 mL van gemodificeerde-Tyrode oplossing voor elke put. Afdekking met folie. 7. photometrie en opladen gekoppelde Apparaatopnames Schakel de apparatuur in de volgende volgorde: Microscoop, Arc lamp, hyperswitch, fluorescentie interface systeem, Myocam voeding, veld stimulator, en computer. Zorg ervoor dat de excitatie/emissie filter sets geschikt zijn voor de Imaging Dye.Opmerking: Fura-2 is enthousiast over 340 nm en 380 nm licht. Het zendt uit op 510 Nm licht. Fluo-4 en de voltage membraan kleurstof zijn opgewonden op 485 nm licht en stoten bij 520 nm licht. Het systeem prikken door het vacuüm in te schakelen, de slangklem volledig te openen en elke spuit van 60 mL die in de variëteit wordt gebruikt zachtjes te plunderen. Voor calcium opnames gebruikt u de oplossing van Tyrode. Voor spannings opnamen gebruikt u de oplossing van gemodificeerde Tyrode. Zet de kachel aan en stel de stroom in door de roller Clamp op de perfusie slang aan te passen. Maak opnames bij 36 ± 1 °C. Open de verwervings software. Zorg ervoor dat de parameters zijn ingesteld voor de juiste Imaging kleurstof. In het donker, verwijder de folie van de zes goed plaat en plaats een dekslip in de pacing kamer. Zorg ervoor dat de stimulator is uitgeschakeld tijdens deze stap. Focus op de myocyten met behulp van de 10x doelstelling. Eenmaal in focus, beginnen pacing door veld te stimuleren op 1 Hz, 0,2 V. Verhoog geleidelijk de spanning tot 1:1 pacing wordt verkregen. Verhoog vervolgens de spanning tot 1,5 x de drempel is bereikt.Opmerking: omdat excitatie-contractie koppeling temperatuur afhankelijk is, moet u ervoor zorgen dat de cellen gedurende 15 minuten voor de opname zijn geperfectiongebruikt. Dit maakt het mogelijk om myocyten te herstellen van de schok van het gaan van kamertemperatuur terug naar 37 ° c evenals losjes aangesloten cellen om weg te zweven. Overschakelen van de 10x-doelstelling naar de 40x-doelstelling. Concentreer u op een cel die een 1:1 pacing volgt. Pas de plastic tinten aan zodat slechts één cel zich in het gezichtsveld bevindt. Met behulp van de software, plaats het gebied van de interesse vak op goed gedefinieerde sarcomeres. Start de acquisitie software om het excitatie lampje te starten. Pas met behulp van de filters met neutrale dichtheid de intensiteits instelling dienovereenkomstig aan om een adequate SRV te verkrijgen.