胚性マウス小脳から単離されたニューロンの一次培養
Summary
インビトロ実験を行い、可能な限り十分な生体内の状態を反映することは容易な作業ではありません。一次細胞培養物の使用は、生物全体の細胞生物学を理解するための重要なステップです。提供されたプロトコルは、正常に成長し、胚性マウス小脳ニューロンを培養する方法を概説します。
Abstract
一次細胞培養物の使用は、インビトロで神経系を研究するための主要なツールの一つとなっています。この簡略化されたモデルシステムを使用する究極の目標は、制御された微小環境を提供し、高い生存率と解失性ニューロンおよび非ニューロン細胞の自然な特徴を、インビトロ条件下で可能な限り維持することです。この記事では、発達中のマウス小脳から一次ニューロンを分離し、インビトロ環境に配置し、その成長を確立し、その生存率と分化を数週間監視する方法を示す。この方法は、12~18日の胚の間に小脳から解離した胚性ニューロンに適用可能である。
Introduction
数十年にわたり、細胞株は前臨床研究や生物学的研究において高スループットツールとして広く使用されてきました。費用対効果、急速な成長、および生きている動物の使用の減少は、これらの細胞を使用するいくつかの利点です。しかしながら、遺伝的変化およびフェノタイプ変化は、インビトロ1のいくつかの通路の後に蓄積する。細胞株の誤認と原発細胞からの遺伝的非類似性は、再現不可能な実験および誤った結論につながる可能性があります2,3,4,5.したがって、ニューロンなどの分化細胞(例えば、神経伝達物質、イオンチャネル、受容体、および他のニューロン特異的タンパク質)に対するいくつかの類似性にもかかわらず、ニューロン細胞株はニューロンの完全な表現型を複製することができません。成熟したニューロンを使用することは別のオプションです。しかしながら、これらの細胞は、培養中に伝播することが困難な非分裂後細胞である。また、細胞周期への再突入は、アポトーシス6を沈殿させ得る。
三次元(3D)細胞培養、オルガノチピックスライス培養、オルガノイド培養物は、細胞がインビボ設定を模倣する3D形態に配置できる環境を提供するために開発されました。従って、細胞間通信、遊走、周囲組織への腫瘍細胞の浸潤、及び血管新生を研究することができる7。しかし、エキストラセルラーマトリックス(ECM)タンパク質または合成ヒドロゲルを寝具として使用する追加コスト、イメージングの難しさ、および高スループットスクリーニング機器との互換性は、3D細胞培養の大きな欠点です。組織組織スライス培養の主な欠点は、多数の動物の使用と軸索の標的および成長因子のアクセス不能につながる軸索の悪影響であり、その結果、神経死8。
したがって、細胞株の問題、成熟細胞の増殖の難しさ、および組織の複雑さを回避する代替アプローチは、未熟な一次細胞のインビトロ成熟である。一次細胞は、ヒトまたは動物組織から直接誘導され、酵素および/または機械的方法9を使用して解離される。培養培地における単離、播種、および維持の主な原則は、組織源に関係なく類似している。しかしながら、増殖および成熟を促進するために必要な栄養因子は、非常に細胞特異的6である。
各小脳細胞型の「生年月日」を知ることは、一次培養実験を設計するための前提条件です。一般に、プルキンエ細胞(PC)および小脳核(CN)のニューロンは、インターニューロン(例えば、バスケット、星細胞)および顆粒細胞を含む小さな細胞の前に生まれる。マウスでは、PCは胚の日(E)10-E13の間に出現し、CNニューロンはおよそE9-E1210で出現する。
他の小脳ニューロンはずっと後に生まれる。例えば、マウスでは、細胞間ニューロンのゴルジ亜集団はVZ(〜E14−E18)から生成され、分子層に位置する残りのインターニューロン(バスケット細胞および星状細胞)は、初期の間に白色物質中の前駆細胞を分割することから出現する出生後 (P)0–P711.顆粒細胞は、ロストラル菱形唇に由来する二次生殖帯(EGZ)から生成され、出生後に末端分裂を経る。しかし、彼らの前駆体がE13-E16の菱形唇から生じる前に、細胞はすでに小脳の肛門の後ろ面に細胞の薄い層を作るためにピア表面に沿ってロストリカルに移行している。心室神経上皮に由来するアストロサイトやオリゴデンドロサイトなどの非神経細胞は、それぞれE13.5-P0およびP0−P7で11、12、13、14で生まれる、15.ミクログリアは、E8-E10間の黄黄嚢原始的な骨髄前駆細胞に由来し、中枢神経系に侵入した後、E916によってマウス脳内で検出することができる。
本稿で提示する方法は、ウィスターラットセレベラ由来のプルキンジェ細胞の一次培養に最適化された古谷ら、17、18、18、すなわち、古谷ら、17、18が開発したものに基づいている。我々は今、この方法を適応させ、マウス小脳ニューロン19の成長を研究するために慎重にそれを変更しました。私たちの新しいプロトコルとは異なり、コールド解剖媒体は、古谷のプロトコル17に播種媒体を追加する前に解離および解離ステップ中に使用される主な洗浄バッファである。この緩衝液は、前述のステップ中に細胞の成長と生存をサポートするために必要な栄養、成長因子、およびホルモン(ダルベッコの改変イーグル培地:栄養混合物F-12[DMEM/F12]のすべて)を欠いている。さらに、マウス一次小脳培養に関する豊富な経験に基づき、各ウェル(1mLではなく)で500μLの培養培地を使用し、神経細胞の成長を改善するトライヨードサイロニン濃度を0.5ng/mLに増加させました。特にプルキンエ細胞表現型のものを有し、培養中の樹状枝の増殖を促進する。この記事で取り上げられている主な方法は、胚発生中に他の小さなげっ歯類(例えば、リスやハムスター)に広く適用することができ、様々な胚期における小脳神経新生と分化を研究するために使用することができます。種間で異なる。
Protocol
Representative Results
Discussion
一次培養物の使用は、すべてのタイプのニューロン17、18、19に適用可能なよく知られた方法である。提示されたプロトコルでは、小脳ニューロンを分離し、最大3週間の体外で最適な生存を有する生存率を維持する方法を説明する。E15-E18で単離された小脳細胞の一次培養は、PC、ゴルジ細胞、およびCNの3つのクラスの大き?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
これらの研究は、自然科学・工学研究評議会(HM:NSERCディスカバリー補助金#RGPIN-2018-06040)、マニトバ州小児病院研究所(HM:グラント#320035)、およびALSカナダ脳カナダアーサーJからの助成金によって支えられました。ハドソントランスレーショナルチームグラント(JK、HM)。
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
