התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים

במשך כמה עשורים, קווי התא שימשו באופן נרחב ככלי תפוקה גבוהה במחקרים פרה-קליניים ומחקר ביולוגי. עלות-תועלת, צמיחה מהירה, והפחתה של השימוש בעלי חיים חיים הם כמה יתרונות של שימוש בתאים אלה. עם זאת, שינויים גנטיים ופנוטיטינוים מצטברים לאחר מספר פסקאות בתוך מבחנה¹. מקריות של קווי תאים וdissimilarity גנטיים מתאים ראשוניים יכולים להוביל לניסויים בחוסר הזדהות ולמסקנות כוזבות^2,3,4,5. לכן, למרות קווי דמיון מסוימים כדי הבדיל תאים כגון נוירונים (למשל, נוירוטרנסמיטורים, ערוצי יון, קולטנים, וחלבונים אחרים בתאי העצב), קווי התאים עצביים לא יכול לשכפל את הפנוטיפ מלא של נוירונים. שימוש בנוירונים מבוגרים הוא אופציה אחרת; עם זאת, תאים אלה אינם מחלקים postmitotic תאים שקשה להפיץ בתרבות. יתר על כן, כניסה מחדש לתוך מחזור התא עשוי לזרז אפופטוזיס⁶.

תרבות תא תלת מימדי (3D), תרביות פרוסה אורגנותמית, ותרבויות אורגנואיד פותחו כדי לספק סביבה שבה תאים יכולים לסדר לתוך טופס 3D המחקה את vivo הגדרה. כך, תקשורת תא אל התא, הגירה, פלישה של תאים סרטניים לתוך הרקמות הסובבות, ו אנגיוגנזה ניתן ללמוד⁷. עם זאת, עלויות נוספות של שימוש מטריצה סלולרית נוספת (ECM) חלבונים או הידרוג’לים סינתטיים כמצע, קושי הדמיה, ותאימות עם מכשירי סינון תפוקה גבוהה הם חסרונות ניכרים של תא 3D culturing. חיסרון משמעותי בתרבות הפרוסה של רקמת הרקמה הוא השימוש במספר רב של בעלי חיים ובהשפעות השליליות של הפיום, המוביל לנגישות של מטרות וגורמי גדילה לאקסונים, וכתוצאה מכך מוות עצבי⁸.

לכן, גישה חלופית, אשר מונעת את הבעיות עם קווי התאים, הקושי של הגידול תאים בוגרים, ומורכבות של רקמות, הוא התבגרות מתורבת של תאים ראשוניים לא בוגרים. התאים הראשוניים נגזרים ישירות מרקמת אדם או בעל חיים ומונתק בשיטות אנזימטיות ו/או מכניות⁹. העקרונות המרכזיים של בידוד, זריעה ותחזוקה במדיום התרבותי דומים ללא קשר למקור הרקמה. עם זאת, הגורמים ההזנה הדרושים כדי לקדם התפשטות והתבגרות הם מאוד מסוימים התא⁶.

לדעת את ‘ הלידה ‘ של כל סוג תא המוח הוא תנאי מוקדם לעיצוב ניסוי התרבות העיקרית. באופן כללי, התאים Purkinje (מחשבים אישיים) ואת הנוירונים של גרעיני המוח (CN), נולדים לפני התאים הקטנים, כולל interneurons (למשל, סל, תאים stellate) ותאי הגרניט. בעכברים, מחשבים מופיעים בין היום העובריים (E) 10 – E13, ואילו נוירונים CN ב כ E9 – E12¹⁰.

. מאוחר יותר נולדים המון נוירונים לדוגמה, בעכברים, אוכלוסיית המשנה של Golgi של האינטרנוירונים נוצרות מ-VZ ב (~ E14-E18) ושאר התאים הביננוירונים (תא סל ותאי stellate) הממוקמים בשכבה המולקולרית מגיחים מחלוקת תאים מחולל בחומר הלבן בין תחילת פוסט לנטאל (P) 0 – P7¹¹. תאי הגרניט מופקים מאזור נבטי חיצוני (EGZ), אזור נבטי משני שנגזר מהשפתיים הrostral מעובית ועובר דרך החטיבה הסופנית לאחר הלידה. אך לפני שהסמנים שלהם נובעים השפה מעובית מ E13 – E16, התאים כבר הועברו rostrally לאורך משטח הפיה כדי ליצור שכבה דקה של תאים על המשטח החלק הפנימי של אנאג המוח. תאי מקרוגליאל ללא עצבי כגון אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך, אשר מקורם של נוירואפיתל המוח, נולדים ב e 13.5-P0 וP0-P7 בהתאמה^{11,12,13,14 ,בן 15} Microglia נגזרות של חלמון-שק מיאלואיד פרימיטיבי התאים בין E8 – E10 ולאחר הפלישה למערכת העצבים המרכזית ניתן לזהות במוח העכבר על ידי E9¹⁶.

השיטה המוצגת במאמר זה מבוססת על האחד שפותח במקור על ידי furuya et al. ו tabata et al.^17,18, אשר היה ממוטב עבור culturing העיקרי של תאים purkinje נגזר של חולדה עכברוש וויסטאר. יש לנו עכשיו להתאים את השיטה הזאת ושינה בקפידה אותו ללמוד את הצמיחה של העכבר מוח הנוירונים¹⁹. בניגוד לפרוטוקול החדש שלנו, מדיום לחיתוך קר הוא מאגר הכביסה העיקרי המשמש במהלך הניתוח ושלבי הדיסוציאציה לפני הוספת מדיום זריעה בפרוטוקול של פאראיה¹⁷. מאגר זה חסר את התזונה, גורמי גדילה, והורמונים (כל בינוני משתנה הנשר מדולקו: תערובת מזינים F-12 [Dמאמ/F12]) כי יש צורך לתמוך צמיחת תאים והישרדות במהלך השלבים הנ ל. בנוסף, בהתבסס על הניסיון הנרחב שלנו עם תרבויות המוח הראשי murine, השתמשנו 500 μl של התרבות הבינונית בכל טוב (במקום 1 mL) והגדילה את הריכוז tri-iothyronine כדי 0.5 ng/mL, אשר משפר את הצמיחה של תאים עצביים, ב במיוחד אלה עם תא מיוחד Purkinje, ומקדם את הצמיחה של ענפים דנדריטים בתרבות. השיטה העיקרית מובלט במאמר זה ניתן להחיל באופן כללי על מכרסמים קטנים אחרים (למשל, סנאים ואוגרים) במהלך פיתוח עובריים ניתן להשתמש כדי ללמוד נוירוגנזה המוח ובידול בשלבים העובריים השונים, אשר שונים בין המינים.