Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Voor enkele decennia, cellijnen zijn op grote schaal gebruikt als een high throughput tool in preklinische studies en biologisch onderzoek. Kosteneffectiviteit, snelle groei en vermindering van het gebruik van levende dieren zijn enkele voordelen van het gebruik van deze cellen. Echter, genetische veranderingen en fenotypische veranderingen accumuleren na verschillende passages in vitro¹. De identificatie van cellijnen en genetische disgelijkenis van primaire cellen kan leiden tot irreproduceer bare experimenten en valse conclusies^2,3,4,5. Daarom, ondanks sommige gelijkenissen met gedifferentieerde cellen zoals neuronen (bijvoorbeeld neurotransmitters, ionenkanalen, receptoren, en andere neuron-specifieke eiwitten), neuronale cellijnen kunnen niet repliceren de volledige fenotype van neuronen. Het gebruik van volwassen neuronen is een andere optie; deze cellen zijn echter niet-delende postmitotische cellen die moeilijk te propageren zijn in cultuur. Bovendien kan opnieuw binnenbrengen in de celcyclus apoptosis⁶neerslaan.

Driedimensionale (3D) celcultuur, organotypische segment culturen en organoïde culturen zijn ontwikkeld om een omgeving te bieden waarin cellen zich kunnen schikken in een 3D-vorm die de in vivo-instelling nabootst. Zo, cel-naar-cel communicatie, migratie, invasie van tumorcellen in de omringende weefsels, en angiogenese kan worden bestudeerd⁷. Extra kosten voor het gebruik van extra cellulaire matrix (ECM) eiwitten of synthetische hydrogels als strooisel, moeite met beeldvorming en compatibiliteit met screening-instrumenten met een hoge doorvoer zijn echter aanzienlijke nadelen van 3D celculturing. Een groot nadeel van organotypic weefsel segment cultuur is het gebruik van een grote hoeveelheid dieren en de nadelige effecten van axotomie, wat leidt tot ontoegankelijkheid van de doelstellingen en groeifactoren voor axonen, en bijgevolg neuronale dood⁸.

Daarom, een alternatieve aanpak, die vermijdt de problemen met cellijnen, de moeilijkheid van het kweken van volwassen cellen, en de complexiteit van de weefsels, is in vitro rijping van onvolgroeide primaire cellen. Primaire cellen worden rechtstreeks afgeleid van menselijk of dierlijk weefsel en gezien met enzymatische en/of mechanische methoden⁹. De belangrijkste principes van isolatie, seeding en onderhoud in kweekmedium zijn vergelijkbaar, ongeacht de weefsel bron. Echter, de trofische factoren die nodig zijn om proliferatie en rijping te bevorderen zijn zeer cel-specifieke⁶.

Het kennen van de ‘ geboortedatum ‘ van elk celtype cerebellaire is een vereiste voor het ontwerpen van een primaire cultuur-experiment. In het algemeen, Purkinje cellen (PCs) en de neuronen van de cerebellaire kernen (CN), worden geboren voor de kleinere cellen, met inbegrip van de interneuronen (bv., mand, stervormige cellen) en submodule cellen. Bij muizen ontstaan Pc’s tussen de embryonale dag (E) 10 – E13, terwijl de CN-neuronen ongeveer E9 – E12¹⁰.

Andere cerebellaire neuronen worden veel later geboren. Bijvoorbeeld, bij muizen wordt de Golgi-subpopulatie van interneuronen gegenereerd van VZ op (~ E14 − E18) en de overgebleven interneuronen (mand cellen en ecoagriturismo late Cells) in de moleculaire laag ontstaan uit het verdelen van voorlopercellen in de witte stof tussen vroege postnatale (P) 0 – P7¹¹. Submodules worden gegenereerd uit de uitwendige Germinal zone (EGZ), een secundaire kiem zone die is afgeleid van de rostrale migratoire Rhombic lip en na de geboorte door Terminal Division gaat. Maar voordat hun precursoren uit de Rhombic lip van E13 – e16 voortvloeien, zijn de cellen al rostraal over het PIA-oppervlak gemigreerd om een dun laagje cellen op het rugoppervlak van het cerebellum Anlage te maken. Niet-neuronale macrogliale cellen zoals astrocyten en oligodendrocyten, die afkomstig zijn van het ventriculaire neuroepitheel, worden geboren bij e 13.5 − P0 en P0 − P7 respectievelijk^{11,12,13,14 ,15}. Microglia zijn afgeleid van dooier-SAC primitieve myeloïde voorlopercellen tussen E8 – E10 en na invasie in het centrale zenuwstelsel kan worden gedetecteerd in de hersenen van de muis door E9¹⁶.

De methode die in dit artikel wordt weergegeven is gebaseerd op degene die oorspronkelijk werd ontwikkeld door Furuya et al. en Tabata et al.^17,18, die was geoptimaliseerd voor primaire kweek van Purkinje cellen afgeleid van Wistar rat cerebella. We hebben deze methode nu aangepast en zorgvuldig aangepast om de groei van muis cerebellaire neuronen¹⁹te bestuderen. In tegenstelling tot ons nieuwe protocol, koude dissectie medium is de belangrijkste wasbuffer gebruikt tijdens dissectie en dissociatie stappen voor het toevoegen van zaaien medium in Furuya protocol¹⁷. Deze buffer mist de voeding, groeifactoren, en hormonen (alles in Dulbecco’s gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F-12 [DMEM/F12]) die nodig zijn ter ondersteuning van de celgroei en overleving tijdens de bovengenoemde stappen. Bovendien hebben we, op basis van onze uitgebreide ervaring met de primaire cerebellaire culturen van Murine, 500 μL van het kweekmedium in elke put gebruikt (in plaats van 1 mL) en de Tri-iodothyronine-concentratie verhoogd tot 0,5 ng/mL, wat de groei van neuronale cellen verbetert, in met name die met een Purkinje-cel fenotype, en bevordert de uitgroei van dendritische takken in de cultuur. De belangrijkste methode in dit artikel kan in grote lijnen worden toegepast op andere kleine knaagdieren (bijv. eekhoorns en hamsters) tijdens de embryonale ontwikkeling en kan worden gebruikt voor de studie van cerebellaire neurogenese en differentiatie in de verschillende embryonale stadia, die verschillen tussen soorten.