Первичная культура нейронов, изолированных от эмбриональной мыши Cerebellum

В течение нескольких десятилетий клеточные линии широко использовались в качестве инструмента высокой пропускной связи в доклинических исследованиях и биологических исследованиях. Рентабельность, быстрый рост и сокращение использования живых животных являются некоторыми преимуществами использования этих клеток. Однако генетические изменения и фенотипические изменения накапливаются после нескольких проходов in vitro^1. Неверная идентификация клеточных линий и генетическая несходность первичных клеток может привести к невоспроизводимым экспериментам и ложным выводам^2,3,4,5. Поэтому, несмотря на некоторое сходство с дифференцированными клетками, такими как нейроны (например, нейротрансмиттеры, ионные каналы, рецепторы и другие нейронно-специфические белки), нейронные клеточные линии не могут воспроизвести полный фенотип нейронов. Использование зрелых нейронов является еще одним вариантом; однако, эти клетки не разделяют постмитотические клетки, которые трудно размножаться в культуре. Кроме того, возвращение в клеточный цикл может привести к апоптозу⁶.

Трехмерная (3D) клеточная культура, органотипические срезные культуры и органоидные культуры были разработаны, чтобы обеспечить среду, в которой клетки могут организовать сявру в 3D-форму, имитирующую настройку in vivo. Таким образом, клеточной связи, миграции, вторжения опухолевых клеток в окружающие ткани, и ангиогенез можно изучить⁷. Однако дополнительные затраты на использование дополнительных клеточных матричных (ECM) белков или синтетических гидрогелей в качестве постельных принадлежностей, трудности в визуализации и совместимость с высокопроизводительными скрининговыми инструментами являются значительными недостатками культивирования 3D-клеток. Основным недостатком культуры органотипических срезов тканей является использование большого количества животных и неблагоприятные последствия акотомии, что приводит к недоступности целей и факторов роста для аксонов, и, следовательно, нейрональной смерти⁸.

Таким образом, альтернативный подход, который позволяет избежать проблем с клеточными линиями, трудности выращивания зрелых клеток, и сложность тканей, является в пробирке созревания незрелых первичных клеток. Первичные клетки получены непосредственно из тканей человека или животного и разобщены с помощью ферментативных и/или механических методов^9. Основные принципы изоляции, посева и поддержания в культурной среде схожи независимо от источника ткани. Тем не менее, трофические факторы, необходимые для содействия распространению и созреванию являются весьма клеточными⁶.

Знание «даты рождения» каждого типа мозжечковой клетки является необходимым условием для разработки первичного эксперимента культуры. В целом, клетки Пуркинье (ПК) и нейроны мочеиссолочных ядер (CN) рождаются перед более мелкими клетками, включая интернейроны (например, корзины, стеллатные клетки) и гранулированные клетки. У мышей, ПК возникают между эмбриональным днем (E)10-E13, в то время как CN нейронов примерно E9-E12¹⁰.

Другие мозжечковые нейроны рождаются гораздо позже. Например, у мышей субпопуляция межнейронов Голги генерируется из ВЗ на уровне (E14-E18), а остальные интернейроны (клетки корзины и стеллатные клетки), расположенные в молекулярном слое, возникают из деления клеток-прародителей в белом веществе между ранними послеродовой (P)0-P7¹¹. Клетки гранул генерируются из внешней зародышевой зоны (ЭГЗ), вторичной зародышевой зоны, которая происходит от ростральной ромбических губ и проходит через терминальное деление после рождения. Но прежде чем их предшественники возникают из ромбических губ от E13-E16, клетки уже мигрировали ростально вдоль поверхности пиа, чтобы сделать тонкий слой клеток на поверхности вращателя алаг. Ненейрональные макроглиальные клетки, такие как астроциты и олигодендроциты, которые происходят из желудочкового нейроэпителия, рождаются в E13.5-P0 и P0-P7 соответственно^{11,12,13,14 ,15}. Микроглия являются производными от желтка-мешок примитивных миелоидных клеток-прародителей между E8-E10 и после вторжения в центральную нервную систему могут быть обнаружены в мозге мыши E9¹⁶.

Метод, представленный в этой статье, основан на методе, первоначально разработанном Furuya et al. и Tabata et al.^17,18,который был оптимизирован для первичного культивирования клеток Пуркинье, полученных из крысиной церебеллы Wistar. Теперь мы адаптировали этот метод и тщательно модифицировали его для изучения роста мозжечковых нейронов мыши¹⁹. В отличие от нашего нового протокола, холодная среда вскрытия является основным буфером стирки, используемым во время рассечения и диссоциации, прежде чем добавить среду посева в протокол Furuya¹⁷. Этот буфер не хватает питания, факторов роста и гормонов (все в Dulbecco в модифицированных Eagle среды: питательная смесь F-12 “DMEM / F12”), которые необходимы для поддержки роста клеток и выживания во время вышеупомянутых шагов. Кроме того, основываясь на нашем обширном опыте работы с мурин первичных мозжечковых культур, мы использовали 500 л культуры среды в каждом колодце (вместо 1 мл) и увеличили концентрацию трийотиронина до 0,5 нг/мл, что улучшает рост нейрональных клеток, в частности те с фенотипом клетки Purkinje, и повышают outgrowth dendritic ветвей в культуре. Основной метод, описанный в этой статье, может быть широко применен к другим мелким грызунам (например, белкам и хомятам) во время эмбрионального развития и может быть использован для изучения мозжечкового нейрогенеза и дифференциации на различных эмбриональных стадиях, которые различаются между видами.