الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية
Summary
اجراء التجارب في المختبر للتفكير في الظروف المجرية باقصي قدر ممكن ليست مهمة سهله. استخدام ثقافات الخلايا الاوليه هو خطوه هامه نحو فهم بيولوجيا الخلية في كائن حي بأكمله. البروتوكول المنصوص عليه الخطوط العريضة كيفيه النمو بنجاح وثقافة الخلايا العصبية المخيخ الفئران الجنينية.
Abstract
أصبح استخدام ثقافات الخلايا الاوليه واحده من الاداات الرئيسية لدراسة الجهاز العصبي في المختبر. الهدف النهائي من استخدام هذا النظام نموذج مبسط هو توفير البيئة الدقيقة التي تسيطر عليها والحفاظ علي معدل البقاء علي قيد الحياة عاليه والسمات الطبيعية للخلايا العصبية وغير العصبية فصل قدر الإمكان تحت الظروف في المختبر. في هذه المقالة ، ونحن نظهر طريقه لعزل الخلايا العصبية الاساسيه من المخيخ الماوس النامية ، ووضعها في بيئة في المختبر ، وإنشاء نموها ، ورصد صلاحيتها والتمايز لعده أسابيع. ينطبق هذا الأسلوب علي الخلايا العصبية الجنينية التي تنفصل عن المخيخ بين الأيام الجنينية 12 – 18.
Introduction
لعده عقود ، وقد استخدمت خطوط الخلايا علي نطاق واسع كاداه عاليه الانتاجيه في الدراسات الاكلينيكيه والبحوث البيولوجية. الفعالية من حيث التكلفة ، والنمو السريع ، والحد من استخدام الحيوانية الحية هي بعض الفوائد من استخدام هذه الخلايا. ومع ذلك ، تتراكم التغييرات الجينية والتغيرات الظاهرية بعد عده مقاطع في المختبر1. يمكن ان يؤدي التعريف الخاطئ لخطوط الخلايا والتشابه الوراثي من الخلايا الاوليه إلى تجارب غير قابله للتكرار واستنتاجات زائفه2و3و4و5. ولذلك ، علي الرغم من بعض أوجه التشابه للخلايا المتمايزة مثل الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، الناقلات العصبية ، قنوات أيون ، مستقبلات ، وغيرها من البروتينات العصبية الخاصة) ، لا يمكن تكرار خطوط الخلايا العصبية النمط الظاهري الكامل للخلايا العصبية. استخدام الخلايا العصبية ناضجه هو خيار آخر. ومع ذلك ، هذه الخلايا غير تقسيم الخلايا للتفتل التي يصعب نشرها في الثقافة. وعلاوة علي ذلك, أعاده الدخول في دوره الخلية قد يعجل المبرمج6.
وقد تم تطوير ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) ، وثقافات الشريحة المجسمة ، والثقافات العضوية لتوفير بيئة يمكن فيها للخلايا ان ترتب في شكل ثلاثي الابعاد يحاكي الاعداد المجري. التالي ، يمكن دراسة الاتصال من خليه إلى خليه ، والهجرة ، وغزو الخلايا السرطانية في الانسجه المحيطة بها ، وتولد الاوعيه7. ومع ذلك ، فان التكاليف الاضافيه لاستخدام المصفوفات الخلوية الاضافيه (ECM) البروتينات أو الهلام المائي الاصطناعية كفراش ، وصعوبة في التصوير ، والتوافق مع أدوات الفحص عاليه الانتاجيه هي عيوب كبيره من الخلايا 3D الخياطة. ومن المساوئ الرئيسية للثقافة النسيجية شريحة النسيج هو استخدام عدد كبير من الكائنات والآثار السلبية للاستئصال ، مما يؤدي إلى عدم الوصول إلى الأهداف وعوامل النمو لaxotomy ، التالي وفاه الخلايا العصبية8.
ولذلك ، فان النهج البديل ، الذي يتجنب المشاكل مع خطوط الخلايا ، وصعوبة نمو الخلايا الناضجة ، وتعقيد الانسجه ، هو في نضج المختبر من الخلايا الاساسيه غير ناضجه. وتستمد الخلايا الاوليه مباشره من الانسجه البشرية أو الحيوانية وتنفصل باستخدام الانزيمات و/أو الطرق الميكانيكية9. المبادئ الرئيسية للعزل ، البذر ، والصيانة في الثقافة المتوسطة متشابهة بغض السواء عن مصدر الانسجه. ومع ذلك ، فان العوامل الغذائية اللازمة لتعزيز الانتشار والنضج هي خلايا محدده جدا6.
ان معرفه “تاريخ الميلاد” لكل نوع من أنواع الخلايا المخيخه شرط أساسي لتصميم تجربه الثقافة الاساسيه. بشكل عام ، والخلايا purkinje (أجهزه الكمبيوتر) والعصبية من نوى المخيخ (CN) ، يولدون قبل الخلايا الصغيرة ، بما في ذلك الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، سله ، والخلايا النجميه) والكريات الحبيبية. في الفئران ، تظهر أجهزه الكمبيوتر بين اليوم الجنيني (E) 10 – E13 ، في حين ان الخلايا العصبية CN في حوالي E9-E1210.
تولد الخلايا العصبية المخيخ الأخرى في وقت لاحق بكثير. علي سبيل المثال ، في الفئران ، يتم توليد السكان الفرعيين golgi من الخلايا العصبية من VZ في (~ E14 − E18) والتداخلات المتبقية (خليه سله والزنزانات النجميه) الموجودة في الطبقة الجزيئية الخروج من تقسيم خلايا السلف في المسالة البيضاء بين أوائل بعد الولادة (P) 0 – P711. يتم إنشاء الخلايا الحبيبية من المنطقة الجرثومية الخارجية (EGZ) ، وهي منطقه الإنبات الثانوية التي تستمد من الشفة المعينة اللحمية وتمر عبر تقسيم المحطة بعد الولادة. ولكن قبل ان تنشا سلائفها من الشفة المعينة من E13 – E16 ، فقد هاجرت الخلايا بالفعل علي طول سطح بيا لجعل طبقه رقيقه من الخلايا علي السطح الظهري لل anlage المخيخ. ولدت خلايا ماكروجليال غير العصبية مثل استروسيتيس و oligodendrocytes ، والتي تنشا من ظهاره عصبيه البطين ، في e 13.5 − P0 و P0 − P7 علي التوالي11،12،13،14 ،15. وتستمد الخلايا الصغيرة من الخلية البدائية للخلايا النخاعية من الصفار بين الساعة8 – 10وبعد الغزو إلى الجهاز العصبي المركزي يمكن الكشف عنها في دماغ الفار بواسطة E9 16.
وتستند الطريقة المعروضة في هذه المقالة علي واحد وضعت أصلا من قبل furuya et al. و tabata et al.17,18, الذي تم الأمثل للذبح الاوليه من الخلايا purkinje المستمدة من wistar الفئران المخيخ. لدينا الآن تكييف هذه الطريقة وتعديلها بعناية لدراسة نمو الخلايا العصبية الفئران المخيخ19. علي عكس في بروتوكولنا الجديد ، الباردة تشريح المتوسط هو المخزن المؤقت الغسيل الرئيسية المستخدمة خلال التشريح والتفكك الخطوات قبل أضافه البذر المتوسطة في البروتوكول Furuya في17. هذا العازل يفتقر إلى التغذية ، وعوامل النمو ، والهرمونات (كل ذلك في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 [DMEM/F12]) التي هي ضرورية لدعم نمو الخلايا والبقاء علي قيد الحياة خلال الخطوات المذكورة أعلاه. الاضافه إلى ذلك ، استنادا إلى خبرتنا الواسعة مع الثقافات المخيخ الاوليه murine ، وقد استخدمنا 500 μL من الوسط الثقافي في كل بئر (بدلا من 1 مل) وزيادة تركيز ثلاثي ايودوثيرونين إلى 0.5 ng/mL ، مما يحسن نمو الخلايا العصبية ، في خاصه تلك التي لديها النمط الظاهري الخلية Purkinje ، ويعزز النمو من فروع شجيري في الثقافة. الطريقة الرئيسية التي ظهرت في هذه المقالة يمكن تطبيقها علي نطاق واسع علي القوارض الصغيرة الأخرى (علي سبيل المثال ، السناجب والهامستر) اثناء النمو الجنيني ويمكن استخدامها لدراسة نشاه الأعصاب المخيخ والتمايز في المراحل الجنينية المختلفة ، والتي تختلف بين الأنواع.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الثقافات الاوليه هو وسيله معروفه تنطبق علي جميع أنواع الخلايا العصبية17،18،19. في البروتوكول المعروض ، ونحن شرح كيفيه عزل الخلايا العصبية المخيخ والحفاظ علي صلاحيتها مع البقاء علي قيد الحياة الأمثل في المختبر لمده أقصاها 3 أسابيع. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكانت هذه الدراسات مدعومة بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (HM: NSERC ديسكفري غرانت # RGPIN-2018-06040) ، ومعهد بحوث مستشفي الأطفال في مانيتوبا (HM: غرانت # 320035) ، وال ALS كندا-الدماغ كندا أرثر J. هدسون منحه فريق الانتقالية (JK ، HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
References
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
