Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell’uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell’utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro¹. L’errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni^2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un’altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l’apoptosi⁶.

Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l’ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l’invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l’angiogenesi possono essere studiate⁷. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell’utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell’imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l’uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell’asotomia, che porta all’inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale⁸.

Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici⁹. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule⁶.

Conoscere la “data di nascita” di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E12¹⁰.

Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P7¹¹. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell’E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell’anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7^{rispettivamente 11,12,13,14 ,15}. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l’invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E9¹⁶.

Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.^17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo¹⁹. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya¹⁷. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.