Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

Por diversas décadas, as linhas de pilha foram amplamente utilizadas como uma ferramenta elevada da passagem em estudos preclinical e na pesquisa biológica. Custo-efetividade, crescimento rápido e redução do uso de animais vivos são alguns benefícios do uso dessas células. No entanto, alterações genéticas e alterações fenotípicas se acumulam após várias passagens in vitro¹. A identificação incorreta das linhas celulares e a dessemelhança genética das células primárias pode levar a experimentos irreprodutíveis e conclusões falsas^2,3,4,5. Portanto, apesar de algumas semelhanças com células diferenciadas, como neurônios (por exemplo, neurotransmissores, canais de íons, receptores e outras proteínas neuronais específicas), as linhas celulares neuronais não podem replicar o fenótipo completo dos neurônios. Usar neurônios maduros é outra opção; no entanto, essas células são células pós-mitocóticas não divisórias que são difíceis de propagar na cultura. Além disso, a reentrada no ciclo celular pode precipitar a apoptose⁶.

Cultura celular tridimensional (3D), culturas organotípicas de fatias e culturas organóides foram desenvolvidas para fornecer um ambiente no qual as células podem organizar em uma forma 3D que imita o cenário in vivo. Assim, a comunicação célula-célula, migração, invasão de células tumorais em tecidos circundantes, e angiogênese pode ser estudado⁷. No entanto, os custos adicionais do uso de proteínas de matriz celular extra (ECM) ou hidrogéis sintéticos como cama, dificuldade em imagem e compatibilidade com instrumentos de triagem de alta taxa de produção são desvantagens consideráveis de cultivo de células 3D. Uma grande desvantagem da cultura organotípica fatia de tecido é o uso de um grande número de animais e os efeitos adversos da axotomia, o que leva à inacessibilidade de alvos e fatores de crescimento para axônios, e, conseqüentemente, a morte neuronal⁸.

Portanto, uma abordagem alternativa, que evita os problemas com as linhas celulares, a dificuldade de crescimento de células maduras e complexidade dos tecidos, é a maturação in vitro das células primárias imaturas. As células primárias são derivadas diretamente do tecido humano ou animal e dissociadas usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos^9. Os principais princípios de isolamento, semeade e manutenção em meio de cultura são semelhantes, independentemente da fonte do tecido. No entanto, os fatores tróficos necessários para promover a proliferação e maturação são altamente específicos^{de células 6.}

Conhecer a “data de nascimento” de cada tipo de célula cerebellar é um pré-requisito para projetar um experimento de cultura primária. Em geral, as células de Purkinje (PCs) e os neurônios dos núcleos cerebelares (CN), nascem diante das células menores, incluindo interneurônios (por exemplo, cesta, células stellate) e células de grânulos. Em camundongos, os PCs emergem entre o dia embrionário (E)10-E13, enquanto os neurônios CN em aproximadamente E9-E12¹⁰.

Outros neurônios cerebelares nascem muito mais tarde. Por exemplo, em camundongos, a subpopulação golgi de interneurônios são gerados a partir de VZ em (~E14-E18) e os interneurônios restantes (células cestos e células stellate) localizados na camada molecular emergem da divisão de células progenitoras na matéria branca entre os primeiros pós-natal (P)0-P7¹¹. As células granule são geradas a partir da zona germinal externa (EGZ), uma zona germinal secundária que é derivada do lábio romébico rostral e passa por divisão terminal após o nascimento. Mas antes de seus precursores surgirem a partir do lábio rébico de E13-E16, as células já migraram rosatralido ao longo da superfície da pia para fazer uma fina camada de células na superfície dorsal do âmino anlage. Células macrogliais não neuronais, como astrócitos e oligodendrócitos, que se originam do neuroepitélio ventricular, nascem em E13,5−P0 e P0−P7 respectivamente^{11,12,13,14 15.} Microglia são derivados de células progenitoras mieloides primitivas de gema-sac entre E8-E10 e após a invasão no sistema nervoso central pode ser detectado no cérebro do rato por E9¹⁶.

O método apresentado neste artigo é baseado no originalmente desenvolvido por Furuya et al. e Tabata et al.^17,18, que foi otimizado para o cultivo primário de células Purkinje derivadas de cerebelo de rato Wistar. Nós já adaptou este método e cuidadosamente modificado para estudar o crescimento dos neurônios cerebelares do rato¹⁹. Ao contrário do nosso novo protocolo, o meio de dissecação a frio é o principal amortecedor de lavagem usado durante as etapas de dissecção e dissociação antes de adicionar o meio de semeada no protocolo¹⁷de Furuya. Este amortecedor não tem a nutrição, fatores de crescimento e hormônios (tudo no meio modificado de Águia de Dulbecco: mistura de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que são necessárias para apoiar o crescimento celular e a sobrevivência durante os passos acima mencionados. Além disso, com base em nossa extensa experiência com culturas cerebelares primárias murina, usamos 500 μL de meio de cultura em cada poço (em vez de 1 mL) e aumentamos a concentração de tri-iodothyronine para 0,5 ng/mL, o que melhora o crescimento das células neuronais, em particularaqueles com um fenótipo de célula sardrugiano Purkinje, e promove a conseqüência de ramos dendríticos na cultura. O principal método apresentado neste artigo pode ser amplamente aplicado a outros pequenos roedores (por exemplo, esquilos e hamsters) durante o desenvolvimento embrionário e pode ser usado para estudar neurogênese cerebelar e diferenciação nas várias fases embrionárias, que diferem entre as espécies.