Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l’aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines offrent un système puissant pour étudier la fonction génique et modéliser des mutations spécifiques pertinentes à la maladie. La génération de modifications génétiques hétérozygotes précises est difficile en raison de la formation d’indéléves médiées par CRISPR-CAS9 dans le deuxième allèle. Ici, nous démontrons un protocole pour aider à surmonter cette difficulté en utilisant deux modèles de réparation dans lesquels un seul exprime le changement de séquence souhaité, tandis que les deux modèles contiennent des mutations silencieuses pour empêcher la re-coupe et la formation d’indel. Cette méthodologie est plus avantageuse pour l’édition de gènes codant les régions de l’ADN pour générer le contrôle isogénique et les lignées de cellules souches humaines mutantes pour étudier la maladie humaine et la biologie. En outre, l’optimisation des méthodologies de transfection et de dépistage a été réalisée pour réduire le travail et le coût d’une expérience d’édition de gènes. Dans l’ensemble, ce protocole est largement applicable à de nombreux projets d’édition du génome utilisant le modèle de cellules souches pluripotentes humaines.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des outils précieux pour modéliser les maladies humaines en raison de leur capacité de renouvellement, tout en maintenant la capacité de générer des types cellulaires de lignées différentes1,2 ,3,4. Ces modèles ouvrent la possibilité d’interroger la fonction génique, et de comprendre comment des mutations spécifiques et des phénotypes sont liés à diverses maladies5,6. Cependant, pour comprendre comment une altération spécifique est liée à un phénotype particulier, l’utilisation d’un contrôle isogénique jumelé et des lignées cellulaires mutantes est important pour contrôler la variabilité ligne à ligne7,8. Des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) et des nucléases de doigts de zinc ont été utilisées pour générer des mutations d’insertion ou de suppression (indels) dans divers modèles génétiques, y compris les cellules primaires; mais ces nucléases peuvent être encombrantes à utiliser et coûteux9,10,11,12,13,14. La découverte de la nucléase palindromic (CRISPR)-CAS9, régulièrement en chevêp, a révolutionné le domaine en raison de l’efficacité de la formation d’indélétaux dans pratiquement n’importe quelle région du génome, de la simplicité d’utilisation et de la réduction du coût15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19.
Un défi dans l’utilisation de la technologie d’édition du génome basée sur CRISPR-CAS9 a été la génération ou la correction de mutations spécifiques dans un allèle sans créer une mutation indel dans le deuxième allèle20. L’objectif principal de ce protocole est de surmonter ce défi en utilisant deux modèles de réparation d’oligonucléotide à brin unique (ssODN) pour réduire la formation d’indel dans le deuxième allèle. Les deux ssODN sont conçus pour contenir des mutations silencieuses pour empêcher le re-découpage par la nucléase CAS9, mais un seul contient la modification de l’intérêt. Cette méthode augmente l’efficacité de générer une modification génétique hétérozygote spécifique sans induire la formation d’indélétaux dans le deuxième allèle. À l’aide de ce protocole, des expériences d’édition de gènes dans six endroits génomiques indépendants démontrent l’introduction précise du changement génomique souhaité dans un allèle sans indel dans le deuxième allèle et se produit avec une efficacité globale de 10 %. Le protocole décrit a été adapté de Maguire et coll.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, l’utilisation de CRISPR-CAS9 ainsi que de deux modèles de réparation ssODN pour générer des changements spécifiques du génome hétérozygote ou homozygotes est démontrée dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode a eu comme conséquence la génération réussie des lignées cellulaires isogéniques exprimant des changements génomiques hétérozygotes avec une efficacité proche de 10%. Ce protocole a été optimisé pour les ESC humains et les iPSC cultivés sur des MEF i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), les National Institutes of Health par le biais de subventions U01HL099656 (P.G. et D.L.F.) et U01HL134696 (P.G. et D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
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