Summary

Génération de modifications génomiques définies à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l’aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines offrent un système puissant pour étudier la fonction génique et modéliser des mutations spécifiques pertinentes à la maladie. La génération de modifications génétiques hétérozygotes précises est difficile en raison de la formation d’indéléves médiées par CRISPR-CAS9 dans le deuxième allèle. Ici, nous démontrons un protocole pour aider à surmonter cette difficulté en utilisant deux modèles de réparation dans lesquels un seul exprime le changement de séquence souhaité, tandis que les deux modèles contiennent des mutations silencieuses pour empêcher la re-coupe et la formation d’indel. Cette méthodologie est plus avantageuse pour l’édition de gènes codant les régions de l’ADN pour générer le contrôle isogénique et les lignées de cellules souches humaines mutantes pour étudier la maladie humaine et la biologie. En outre, l’optimisation des méthodologies de transfection et de dépistage a été réalisée pour réduire le travail et le coût d’une expérience d’édition de gènes. Dans l’ensemble, ce protocole est largement applicable à de nombreux projets d’édition du génome utilisant le modèle de cellules souches pluripotentes humaines.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des outils précieux pour modéliser les maladies humaines en raison de leur capacité de renouvellement, tout en maintenant la capacité de générer des types cellulaires de lignées différentes1,2 ,3,4. Ces modèles ouvrent la possibilité d’interroger la fonction génique, et de comprendre comment des mutations spécifiques et des phénotypes sont liés à diverses maladies5,6. Cependant, pour comprendre comment une altération spécifique est liée à un phénotype particulier, l’utilisation d’un contrôle isogénique jumelé et des lignées cellulaires mutantes est important pour contrôler la variabilité ligne à ligne7,8. Des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) et des nucléases de doigts de zinc ont été utilisées pour générer des mutations d’insertion ou de suppression (indels) dans divers modèles génétiques, y compris les cellules primaires; mais ces nucléases peuvent être encombrantes à utiliser et coûteux9,10,11,12,13,14. La découverte de la nucléase palindromic (CRISPR)-CAS9, régulièrement en chevêp, a révolutionné le domaine en raison de l’efficacité de la formation d’indélétaux dans pratiquement n’importe quelle région du génome, de la simplicité d’utilisation et de la réduction du coût15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19.

Un défi dans l’utilisation de la technologie d’édition du génome basée sur CRISPR-CAS9 a été la génération ou la correction de mutations spécifiques dans un allèle sans créer une mutation indel dans le deuxième allèle20. L’objectif principal de ce protocole est de surmonter ce défi en utilisant deux modèles de réparation d’oligonucléotide à brin unique (ssODN) pour réduire la formation d’indel dans le deuxième allèle. Les deux ssODN sont conçus pour contenir des mutations silencieuses pour empêcher le re-découpage par la nucléase CAS9, mais un seul contient la modification de l’intérêt. Cette méthode augmente l’efficacité de générer une modification génétique hétérozygote spécifique sans induire la formation d’indélétaux dans le deuxième allèle. À l’aide de ce protocole, des expériences d’édition de gènes dans six endroits génomiques indépendants démontrent l’introduction précise du changement génomique souhaité dans un allèle sans indel dans le deuxième allèle et se produit avec une efficacité globale de 10 %. Le protocole décrit a été adapté de Maguire et coll.21.

Protocol

1. Conception et construction de l’ARN de guide (gRNA) REMARQUE: Chaque gRNA est composé de deux 60 paires de base (bp) oligonucléotides qui sont annealed pour générer un 100 bp double échoué (ds) oligonucléotide (Figure 1A-C). Le délai pour la conception, la génération et l’efficacité de coupe de test de gRNA est d’environ 2 semaines (figure 2). Sélectionnez la région d’adn d’intérêt à modif…

Representative Results

Génération de gARN et dépistage des indels Chaque gRNA sera cloné dans un vecteur plasmide et exprimé à l’aide du promoteur U6. L’enzyme de restriction AflII est utilisée pour linéariser le plasmide (addgene #41824) et est située après le promoteur U6. La bande de 100 pb générée après l’annexion des deux oligos de 60 pb est clonée dans le vecteur d’expression gRNA à l’aide de l’assemblage de l’ADN. Une fois que les plasmides gRNA sont générés, ils s…

Discussion

Dans ce protocole, l’utilisation de CRISPR-CAS9 ainsi que de deux modèles de réparation ssODN pour générer des changements spécifiques du génome hétérozygote ou homozygotes est démontrée dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode a eu comme conséquence la génération réussie des lignées cellulaires isogéniques exprimant des changements génomiques hétérozygotes avec une efficacité proche de 10%. Ce protocole a été optimisé pour les ESC humains et les iPSC cultivés sur des MEF i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), les National Institutes of Health par le biais de subventions U01HL099656 (P.G. et D.L.F.) et U01HL134696 (P.G. et D.L.F.).

Materials

5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Corning 352235
6-well polystyrene tissue culture dishes Corning 353046
AflII restriction endonuclease New England Biolabs R0520
Agarose VWR N605
DMEM/F12 medium ThermoFisher 11320033
dNTPs Roche 11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit Macherey-Nagel 740609
Gibson Assembly Kit New England Biolabs E2611
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent ThermoFisher (STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector Addgene 44719
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer New England Biolabs M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K210011
Proteinase K Qiagen Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells Takara 636763
SOC medium New England Biolabs B9020S
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher 12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) Tocris 1254

References

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Cite This Article
Cardenas-Diaz, F. L., Maguire, J. A., Gadue, P., French, D. L. Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60085, doi:10.3791/60085 (2019).

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