ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

ヒト胚性幹細胞(HESC)および誘導多能性幹細胞(iPSC)は、異なる系統の細胞型を生成する能力を維持しながら、更新能力のためにヒト疾患をモデル化するための貴重なツール^{である1,2 、3、4.}これらのモデルは、遺伝子機能を調知する可能性を開き、特定の変異および文言型が様々な^疾患5,6にどのように関連しているかを理解する。しかしながら、特定の変化が特定の表現型にどのように連結されるかを理解するためには、対同原性制御および変異細胞株の使用は、線対線変動^性7、8を制御するために重要である。転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)および亜鉛フィンガーヌクレアーゼは、原発細胞を含む多様な遺伝モデルにおける挿入または欠失(インデル)変異を生成するために使用されてきた。しかし、これらのヌクレアーゼは、使用し、高価な9、10、11、12、13、14を使用するのが面倒なことができます。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート(CRISPR)-CAS9ヌクレアーゼの発見は、ゲノムの事実上あらゆる領域におけるインデル形成の効率、使用の簡素化、およびコストの削減により、フィールドに革命を起こしました^{15,16歳,17歳,18歳,19}.

CRISPR-CAS9ベースのゲノム編集技術を用いる上での課題は、^{第2対立遺伝子20}にインデル変異を作成することなく、1つの対立遺伝子における特定の突然変異の生成または補正であった。このプロトコルの主な目標は、2本鎖オリゴヌクレオチド(ssODN)修復テンプレートを使用して、第2対立遺伝子のインデル形成を減少させるために、この課題を克服することです。両方のssODNは、CAS9ヌクレアーゼによる再切断を防ぐために無声突然変異を含むように設計されていますが、目的の変化が含まれているのは1つだけです。この方法は、第2対立遺伝子におけるインデル形成を誘導することなく、特定のヘテロザイゴウス遺伝子改変を生成する効率を高める。このプロトコルを用いて、6つの独立したゲノム位置における遺伝子編集実験は、第2対立遺伝子におけるインデル形成なしで1つの対立遺伝子における所望のゲノム変化の正確な導入を実証し、〜10%の全体的な効率で起こる。記載されたプロトコルは、Maguireら^ら21から適応されている。