Summary

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Erleichterung der Erzeugung definierter heterozygoter oder homozygoter Nukleotid-Änderungen mit CRISPR-CAS9 in menschlichen pluripotenten Stammzellen.

Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen bieten ein leistungsfähiges System, um die Genfunktion zu untersuchen und modellspezifische Mutationen zu modellieren, die für Krankheiten relevant sind. Die Erzeugung präziser heterozygoter genetischer Modifikationen ist aufgrund der CRISPR-CAS9-vermittelten Indelbildung im zweiten Allel eine Herausforderung. Hier zeigen wir ein Protokoll, um diese Schwierigkeit zu überwinden, indem wir zwei Reparaturvorlagen verwenden, in denen nur eine die gewünschte Sequenzänderung ausdrückt, während beide Vorlagen stille Mutationen enthalten, um Nachschneiden und Indelbildung zu verhindern. Diese Methode ist am vorteilhaftesten für Gen-Editing-Codierungsregionen der DNA, um isogene Kontrolle und mutierte menschliche Stammzelllinien für die Untersuchung menschlicher Krankheiten und Biologie zu generieren. Darüber hinaus wurden Optimierungen von Transfektions- und Screening-Methoden durchgeführt, um Arbeit und Kosten eines Gen-Editing-Experiments zu reduzieren. Insgesamt ist dieses Protokoll weithin auf viele Genom-Editing-Projekte anwendbar, die das menschliche pluripotente Stammzellmodell verwenden.

Introduction

Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind wertvolle Werkzeuge zur Modellierung menschlicher Krankheiten aufgrund ihrer Fähigkeit zur Erneuerung, wobei die Fähigkeit zur Erzeugung von Zelltypen verschiedener Abstammungen beibehalten wird1,2 ,3,4. Diese Modelle eröffnen die Möglichkeit, die Genfunktion zu befragen und zu verstehen, wie spezifische Mutationen und Phänotypen mit verschiedenen Krankheiten zusammenhängen5,6. Um jedoch zu verstehen, wie eine bestimmte Veränderung mit einem bestimmten Phänotyp verbunden ist, ist die Verwendung einer gepaarten isogenen Kontrolle und mutierter Zelllinien wichtig, um die Linien-zu-Linienvariabilität7,8zu steuern. Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) und Zinkfingernukleasen wurden verwendet, um Insertions- oder Deletionsmutationen (Indels) in verschiedenen genetischen Modellen, einschließlich Primärzellen, zu erzeugen; aber diese Nukleasen können umständlich zu bedienen und teuersein 9,10,11,12,13,14. Die Entdeckung der gruppierten regelmäßig interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CAS9 Nuklease hat das Feld aufgrund der Effizienz in der Indelbildung in praktisch jeder Region des Genoms, der Einfachheit der Anwendung und der Senkung der Kosten revolutioniert15 , 16 , 17 , 18 , 19.

Eine Herausforderung bei der Verwendung der CRISPR-CAS9-basierten Genom-Editing-Technologie war die Erzeugung oder Korrektur spezifischer Mutationen in einem Allel, ohne eine Indelmutation im zweiten Allel20zu erzeugen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, diese Herausforderung zu überwinden, indem zwei einsträngige Oligonukleotid (ssODN) Reparaturvorlagen verwendet werden, um die Indelbildung im zweiten Allel zu reduzieren. Beide ssODNs sind so konzipiert, dass sie stille Mutationen enthalten, um ein erneutes Schneiden durch die CAS9-Nuklease zu verhindern, aber nur eine enthält die Veränderung des Interesses. Diese Methode erhöht die Effizienz der Erzeugung einer spezifischen heterozygoten genetischen Veränderung, ohne induzieren Indelbildung im zweiten Allel. Anhand dieses Protokolls zeigen Gen-Editing-Experimente an sechs unabhängigen genomischen Standorten die genaue Einführung der gewünschten genomischen Veränderung in einem Allel ohne Indelbildung im zweiten Allel und treten mit einer Gesamteffizienz von 10 % auf. Das beschriebene Protokoll wurde von Maguire et al.21angepasst.

Protocol

1. Entwurf und Konstruktion von Guide RNA (gRNA) HINWEIS: Jede gRNA besteht aus zwei 60 Basenpaar (bp) Oligonukleotiden, die geglüht werden, um ein 100 bp Doppelsträngiges (ds) Oligonukleotid zu erzeugen (Abbildung 1A-C). Der Zeitplan für die Effizienz des gRNA-Designs, der Erzeugung und des Testens beträgt ca. 2 Wochen (Abbildung 2). Wählen Sie den DNA-Bereich aus, der für das Genom von Interesse ist,…

Representative Results

Generierung von gRNAs und Screening für Indels Jede gRNA wird in einen Plasmidvektor geklont und mit dem U6-Promotor exprimiert. Das AflII Restriktionsenzym wird zur Linearisierung des Plasmids (Addgen #41824) verwendet und befindet sich nach dem U6-Promotor. Das nach dem Glühen der beiden 60 bp Oligos erzeugte 100 bp-Band wird mit Hilfe der DNA-Assembly in den gRNA-Expressionsvektor geklont. Sobald die gRNA-Plasmide erzeugt sind, werden sie zusammen mit einem CRISP…

Discussion

In diesem Protokoll wird die Verwendung von CRISPR-CAS9 zusammen mit zwei ssODN-Reparaturvorlagen zur Erzeugung spezifischer heterozygoter oder homozygoter Genomveränderungen in menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen. Diese Methode führte zur erfolgreichen Erzeugung isogener Zelllinien, die heterozygote genomische Veränderungen mit einer Effizienz von fast 10 % exdrücken. Dieses Protokoll wurde sowohl für menschliche ESCs als auch für iPSCs optimiert, die auf bestrahlten MEFs angebaut werden, die das Z…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde durch Fördermittel des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health durch Die Stipendien U01HL099656 (P.G. und D.L.F.) und U01HL134696 (P.G. und D.L.F.) unterstützt.

Materials

5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Corning 352235
6-well polystyrene tissue culture dishes Corning 353046
AflII restriction endonuclease New England Biolabs R0520
Agarose VWR N605
DMEM/F12 medium ThermoFisher 11320033
dNTPs Roche 11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit Macherey-Nagel 740609
Gibson Assembly Kit New England Biolabs E2611
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent ThermoFisher (STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector Addgene 44719
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer New England Biolabs M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K210011
Proteinase K Qiagen Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells Takara 636763
SOC medium New England Biolabs B9020S
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher 12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) Tocris 1254

References

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Cite This Article
Cardenas-Diaz, F. L., Maguire, J. A., Gadue, P., French, D. L. Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60085, doi:10.3791/60085 (2019).

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