Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti umane offrono un potente sistema per studiare la funzione genica e modellare mutazioni specifiche rilevanti per la malattia. La generazione di precise modifiche genetiche eterozigole è impegnativa a causa della formazione indel mediata da CRISPR-CAS9 nel secondo allele. Qui, dimostriamo un protocollo per aiutare a superare questa difficoltà utilizzando due modelli di riparazione in cui solo uno esprime il cambiamento di sequenza desiderato, mentre entrambi i modelli contengono mutazioni silenziose per prevenire il taglio e la formazione dell’indel. Questa metodologia è più vantaggiosa per la codifica genica delle regioni del DNA per generare il controllo isogenico e linee di cellule staminali umane mutanti per lo studio delle malattie umane e della biologia. Inoltre, sono state eseguite ottimizzazioni delle metodologie di trasfezione e screening per ridurre il lavoro e il costo di un esperimento di editing genico. Nel complesso, questo protocollo è ampiamente applicabile a molti progetti di editing del genoma che utilizzano il modello di cellule staminali pluripotenti umane.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono strumenti preziosi per modellare le malattie umane a causa della loro capacità di rinnovamento, pur mantenendo la capacità di generare tipi di cellule di linee diverse1,2 ,3,4. Questi modelli aprono la possibilità di interrogare la funzione genica e capiscono come mutazioni e fenotipi specifici siano correlati a varie malattie5,6. Tuttavia, per capire come una specifica alterazione sia collegata a un particolare fenotipo, l’uso di un controllo isogenico accoppiato e di linee cellulari mutanti è importante controllare per la variabilità da linea a linea7,8. Le nucleasi (TALEN) e le nucleasi di dita di zinco sono state utilizzate per generare mutazioni di inserimento o delezione (indels) in diversi modelli genetici, comprese le cellule primarie; ma queste nucleasi possono essere ingombranti da usare e costosi9,10,11,12,13,14. La scoperta della nuclea a breve ripetizione palindromica corta (CRISPR)-CAS9 del cluster regolarmente interspazio ha rivoluzionato il campo grazie all’efficienza nella formazione dell’indel in praticamente in qualsiasi regione del genoma, semplicità d’uso e riduzione dei costi15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19.
Una sfida nell’utilizzo della tecnologia di editing genomico basata su CRISPR-CAS9 è stata la generazione o la correzione di mutazioni specifiche in un allele senza creare una mutazione indel nel secondo allele20. L’obiettivo principale di questo protocollo è quello di superare questa sfida utilizzando due modelli di riparazione di oligonucleotidi a filamento singolo (ssODN) per ridurre la formazione dell’indel nel secondo allele. Entrambi gli ssODN sono progettati per contenere mutazioni silenziose per prevenire il re-taglio da parte della nucleacanda CAS9, ma solo uno contiene l’alterazione dell’interesse. Questo metodo aumenta l’efficienza di generare una specifica modifica genetica eterozigola senza indurre la formazione dell’indele nel secondo allele. Utilizzando questo protocollo, gli esperimenti di editing genico in sei luoghi genomici indipendenti dimostrano l’introduzione precisa del cambiamento genomico desiderato in un allele senza formazione dell’indele nel secondo allele e si verifica con un’efficienza complessiva del 10%. Il protocollo descritto è stato adattato da Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, l’uso di CRISPR-CAS9 insieme a due modelli di riparazione ssODN per generare specifici cambiamenti del genoma eterozigoo o omozigo è dimostrato nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo ha portato alla generazione di successo di linee cellulari isogeniche che esprimono cambiamenti genomici eterozie con un’efficienza vicina al 10%. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per le ESC umane che per gli iPSC cresciuti su MEF irradiati che supportano la crescita e la sopravvivenza dell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti del National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health attraverso sovvenzioni U01HL099656 (P.G. e D.L.F.) e U01HL134696 (P.G. e D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
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