Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas
Summary
Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.
Abstract
As células-tronco pluripotentes humanas oferecem um poderoso sistema para estudar a função gênica e modelar mutações específicas relevantes para a doença. A geração de modificações genéticas heterozygous precisas é desafiante devido à formação negociada do Indel de CRISPR-CAS9 no segundo alelo. Aqui, demonstramos um protocolo para ajudar a superar essa dificuldade usando dois modelos de reparo em que apenas um expressa a mudança de sequência desejada, enquanto ambos os modelos contêm mutações silenciosas para evitar a formação de recorte e INDEL. Esta metodologia é mais vantajosa para a edição de genes codificando regiões de DNA para gerar controle isogênico e linhas de células-tronco humanas mutantes para estudar doenças humanas e biologia. Além disso, a otimização das metodologias de transfecção e triagem foi realizada para reduzir o trabalho e o custo de um experimento de edição de genes. Globalmente, este protocolo é amplamente aplicável a muitos projetos de edição de genoma utilizando o modelo de células-tronco pluripotentes humanos.
Introduction
Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são ferramentas valiosas para modelar a doença humana devido à sua capacidade de renovação, mantendo a capacidade de gerar tipos de células de diferentes linhagens1,2 ,3,4. Estes modelos abrem a possibilidade interrogar a função do gene, e compreendem como as mutações e os fenótipos específicos são relacionados às várias doenças5,6. No entanto, para entender como uma alteração específica está ligada a um fenótipo específico, o uso de um controle isogênico pareado e de linhagens celulares mutantes é importante para o controle da variabilidade da linha para a linha7,8. A transcrição ativador-como os nucleases efetoras (TALENs) e os nucleases do dedo do zinco foram usados para gerar mutações da inserção ou do apagamento (indels) em modelos genéticos diversos, incluindo pilhas preliminares; Mas esses nucleases podem ser complicados de usar e caros9,10,11,12,13,14. A descoberta da repetição palindromic curta interespaçada agrupada regularmente (CRISPR)-a nuclease de CAS9 revolucionou o campo devido à eficiência na formação do Indel em virtualmente toda a região do genoma, na simplicidade do uso, e na redução no custo15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , a 19.
Um desafio em usar a tecnologia de edição baseada do genoma de CRISPR-CAS9 foi a geração ou a correção de mutações específicas em um alelo sem criar uma mutação do Indel no segundo alelo20. O principal objetivo deste protocolo é superar esse desafio usando dois modelos de reparo de oligonucleotídeo (ssODN) de cadeia única para reduzir a formação de Indel no segundo alelo. Ambos ssODNs são projetados para conter mutações silenciosas para evitar o re-corte pela nuclease CAS9, mas apenas um contém a alteração de interesse. Este método aumenta a eficiência de gerar uma modificação genética heterozygous específica sem induzir a formação do Indel no segundo alelo. Usando este protocolo, as experiências de edição do gene em seis posições genomic independentes demonstram a introdução exata da mudança genomic desejada em um alelo sem formação do Indel no segundo alelo e ocorre com uma eficiência total de ~ 10%. O protocolo descrito foi adaptado de Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, o uso de CRISPR-CAS9 junto com dois moldes do reparo de ssODN para gerar mudanças heterozygous ou homozygous específicas do genoma é demonstrado em pilhas de haste pluripotentes humanas. Este método conduziu à geração bem sucedida de linhas de pilha isogênicos que expressam mudanças genomic heterozygous com uma eficiência perto de 10%. Este protocolo foi aperfeiçoado para ambos os ESCs e os iPSCs humanos crescidos em MEFs irradiados que apoiam o crescimento e a sobrevivência da pilha após a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue (NHLBI), institutos nacionais de saúde através de subsídios U01HL099656 (PG e D.L.F.) e U01HL134696 (PG e D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
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