Summary

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Abstract

As células-tronco pluripotentes humanas oferecem um poderoso sistema para estudar a função gênica e modelar mutações específicas relevantes para a doença. A geração de modificações genéticas heterozygous precisas é desafiante devido à formação negociada do Indel de CRISPR-CAS9 no segundo alelo. Aqui, demonstramos um protocolo para ajudar a superar essa dificuldade usando dois modelos de reparo em que apenas um expressa a mudança de sequência desejada, enquanto ambos os modelos contêm mutações silenciosas para evitar a formação de recorte e INDEL. Esta metodologia é mais vantajosa para a edição de genes codificando regiões de DNA para gerar controle isogênico e linhas de células-tronco humanas mutantes para estudar doenças humanas e biologia. Além disso, a otimização das metodologias de transfecção e triagem foi realizada para reduzir o trabalho e o custo de um experimento de edição de genes. Globalmente, este protocolo é amplamente aplicável a muitos projetos de edição de genoma utilizando o modelo de células-tronco pluripotentes humanos.

Introduction

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são ferramentas valiosas para modelar a doença humana devido à sua capacidade de renovação, mantendo a capacidade de gerar tipos de células de diferentes linhagens1,2 ,3,4. Estes modelos abrem a possibilidade interrogar a função do gene, e compreendem como as mutações e os fenótipos específicos são relacionados às várias doenças5,6. No entanto, para entender como uma alteração específica está ligada a um fenótipo específico, o uso de um controle isogênico pareado e de linhagens celulares mutantes é importante para o controle da variabilidade da linha para a linha7,8. A transcrição ativador-como os nucleases efetoras (TALENs) e os nucleases do dedo do zinco foram usados para gerar mutações da inserção ou do apagamento (indels) em modelos genéticos diversos, incluindo pilhas preliminares; Mas esses nucleases podem ser complicados de usar e caros9,10,11,12,13,14. A descoberta da repetição palindromic curta interespaçada agrupada regularmente (CRISPR)-a nuclease de CAS9 revolucionou o campo devido à eficiência na formação do Indel em virtualmente toda a região do genoma, na simplicidade do uso, e na redução no custo15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , a 19.

Um desafio em usar a tecnologia de edição baseada do genoma de CRISPR-CAS9 foi a geração ou a correção de mutações específicas em um alelo sem criar uma mutação do Indel no segundo alelo20. O principal objetivo deste protocolo é superar esse desafio usando dois modelos de reparo de oligonucleotídeo (ssODN) de cadeia única para reduzir a formação de Indel no segundo alelo. Ambos ssODNs são projetados para conter mutações silenciosas para evitar o re-corte pela nuclease CAS9, mas apenas um contém a alteração de interesse. Este método aumenta a eficiência de gerar uma modificação genética heterozygous específica sem induzir a formação do Indel no segundo alelo. Usando este protocolo, as experiências de edição do gene em seis posições genomic independentes demonstram a introdução exata da mudança genomic desejada em um alelo sem formação do Indel no segundo alelo e ocorre com uma eficiência total de ~ 10%. O protocolo descrito foi adaptado de Maguire et al.21.

Protocol

1. projeto e construção do RNA do guia (gRNA) Nota: cada gRNA é composto de 2 60 pares de base (BP) oligonucleotídeos que são recozidos para gerar um 100 BP duplo encalhado (DS) oligonucleotide (Figura 1a-C). A linha do tempo para o projeto gRNA, geração e eficiência de corte de testes é de aproximadamente 2 semanas (Figura 2). Selecione a região de DNA de interesse a ser editado pelo genoma e iden…

Representative Results

Geração de gRNAs e triagem para indels Cada gRNA será clonado em um vetor de plasmídeo e expressado usando o promotor U6. A enzima de restrição AFLII é usada para linearizar o plasmídeo (addgene #41824) e está localizada após o promotor U6. A faixa de 100 BP gerada após o recozimento do 2 60 BP oligos é clonada no vetor da expressão de gRNA usando o conjunto do ADN. Uma vez que os plasmídeo de grna são gerados, são transfected em hESCs ou em iPSCs junt…

Discussion

Neste protocolo, o uso de CRISPR-CAS9 junto com dois moldes do reparo de ssODN para gerar mudanças heterozygous ou homozygous específicas do genoma é demonstrado em pilhas de haste pluripotentes humanas. Este método conduziu à geração bem sucedida de linhas de pilha isogênicos que expressam mudanças genomic heterozygous com uma eficiência perto de 10%. Este protocolo foi aperfeiçoado para ambos os ESCs e os iPSCs humanos crescidos em MEFs irradiados que apoiam o crescimento e a sobrevivência da pilha após a …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue (NHLBI), institutos nacionais de saúde através de subsídios U01HL099656 (PG e D.L.F.) e U01HL134696 (PG e D.L.F.).

Materials

5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Corning 352235
6-well polystyrene tissue culture dishes Corning 353046
AflII restriction endonuclease New England Biolabs R0520
Agarose VWR N605
DMEM/F12 medium ThermoFisher 11320033
dNTPs Roche 11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit Macherey-Nagel 740609
Gibson Assembly Kit New England Biolabs E2611
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent ThermoFisher (STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector Addgene 44719
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer New England Biolabs M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K210011
Proteinase K Qiagen Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells Takara 636763
SOC medium New England Biolabs B9020S
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher 12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) Tocris 1254

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Cite This Article
Cardenas-Diaz, F. L., Maguire, J. A., Gadue, P., French, D. L. Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60085, doi:10.3791/60085 (2019).

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