Generatie van gedefinieerde genomische modificaties met CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Dit protocol biedt een methode om het genereren van gedefinieerde heterozygoot of homozygoot nucleotide veranderingen te vergemakkelijken met behulp van CRISPR CAS9 in menselijke pluripotente stamcellen.
Abstract
Menselijke pluripotente stamcellen bieden een krachtig systeem om de genfunctie te bestuderen en specifieke mutaties te modelleren die relevant zijn voor de ziekte. Het genereren van precieze heterozygoot genetische modificaties is uitdagend als gevolg van CRISPR CAS9 gemedieerde Indel vorming in het tweede allel. Hier demonstreren we een protocol om deze moeilijkheid te helpen overwinnen door twee reparatie sjablonen te gebruiken waarin slechts één de gewenste sequentie wijziging tot uitdrukking brengt, terwijl beide templates stille mutaties bevatten om hersnijden en Indel vorming te voorkomen. Deze methodologie is het meest voordelig voor genbewerkings coderings gebieden van DNA om isogene controle en Mutant menselijke stamcellijnen te genereren voor het bestuderen van menselijke ziekten en biologie. Daarnaast is optimalisatie van transfectie-en screenings methodieken uitgevoerd om de arbeid en de kosten van een genbewerkingsexperiment te verminderen. Over het algemeen is dit protocol algemeen toepasbaar op vele genoom bewerkings projecten met gebruikmaking van het menselijke pluripotente stamcel model.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hescs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (ipscs) zijn waardevolle hulpmiddelen voor het modelleren van menselijke ziekten als gevolg van hun vernieuwings capaciteit, met behoud van de mogelijkheid om celtypen van verschillende lijn afstanden te genereren1,2 ,3,4. Deze modellen openen de mogelijkheid om de genfunctie te interromen en te begrijpen hoe specifieke mutaties en fenotypes gerelateerd zijn aan verschillende ziekten5,6. Echter, om te begrijpen hoe een specifieke wijziging is gekoppeld aan een bepaald fenotype, is het gebruik van een gepaarde isogene controle en Mutante cellijnen belangrijk om te controleren op lijn tot lijn variabiliteit7,8. Transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (TALENs) en zink vinger nucleasen zijn gebruikt voor het genereren van inbrengen of verwijderen (indels) mutaties in diverse genetische modellen, met inbegrip van primaire cellen; maar deze nucleasen kunnen omslachtig te gebruiken en duur9,10,11,12,13,14. De ontdekking van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalings (CRISPR)-CAS9 Nuclease heeft het veld veranderd als gevolg van efficiëntie in Indel-vorming in vrijwel elke regio van het genoom, eenvoud van gebruik en reductie in kosten15 , 16 , 17 , 18 , 19.
Een uitdaging bij het gebruik van de op crispr CAS9 gebaseerde genoom Editing-technologie is het genereren of corrigeren van specifieke mutaties in één allel zonder een Indel-mutatie te creëren in het tweede allel20. Het belangrijkste doel van dit protocol is om deze uitdaging te overwinnen door gebruik te maken van twee enkel-streng oligonucleotide (ssODN) reparatie templates om Indel vorming in het tweede allel te verminderen. Beide ssODNs zijn ontworpen om stille mutaties te bevatten om hersnijden door de CAS9 Nuclease te voorkomen, maar slechts één bevat de verandering van belang. Deze methode verhoogt de efficiëntie van het genereren van een specifieke heterozygoot genetische modificatie zonder het induceren van Indel vorming in het tweede allel. Met behulp van dit protocol tonen genbewerkingsexperimenten in zes onafhankelijke genomische locaties de precieze introductie van de gewenste genomische verandering in één allel zonder Indel-vorming in het tweede allel en treedt op met een totale efficiëntie van ~ 10%. Het beschreven protocol is aangepast van Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol wordt het gebruik van CRISPR CAS9 samen met twee ssODN-reparatie sjablonen voor het genereren van specifieke heterozygoot-of homozygoot-genoom veranderingen aangetoond in menselijke pluripotente stamcellen. Deze methode resulteerde in de succesvolle generatie van isogene cellijnen die heterozygoot genomische veranderingen uitdrukken met een efficiëntie dicht bij 10%. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zowel menselijke Esc’s en iPSCs geteeld op bestraalde Mef’s die celgroei en overleving ondersteunen na…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de financiering van het nationaal hart, het Long-en het bloed Instituut (NHLBI), de National Institutes of Health via subsidies U01HL099656 (P.G. en D.L.F.) en U01HL134696 (P.G. en D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
