Summary

توليد تعديلات جينية محددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة لتسهيل توليد تغييرات النيوكليوتيدات المتجانسة أو المتجانسة المحددة باستخدام CRISPR-CAS9 في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى.

Abstract

توفر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى نظامًا قويًا لدراسة وظيفة الجينات ونمذجة الطفرات المحددة ذات الصلة بالمرض. إن توليد تعديلات جينية دقيقة غير متجانسة يشكل تحدياً بسبب تشكيل الإندل بوساطة كريسبر-كاس9 في الأليل الثاني. هنا، نقوم بإظهار بروتوكول للمساعدة في التغلب على هذه الصعوبة باستخدام اثنين من قوالب الإصلاح التي واحدة فقط يعبر عن تغيير التسلسل المطلوب، في حين أن كلا النموذجين تحتوي على طفرات صامتة لمنع إعادة قطع وتشكيل indel. هذه المنهجية هي الأكثر فائدة لتحرير الجينات مناطق الترميز من الحمض النووي لتوليد السيطرة المسببة للسرطان ومتحولة خطوط الخلايا الجذعية البشرية لدراسة الأمراض البشرية والبيولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين منهجيات التغوط والفحص إلى أقصى حد للحد من العمالة وتكلفة تجربة تحرير الجينات. وبشكل عام، ينطبق هذا البروتوكول على نطاق واسع على العديد من مشاريع تحرير الجينوم التي تستخدم نموذج الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القوى.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي أدوات قيمة لنمذجة الأمراض البشرية بسبب قدرتها على التجديد، مع الحفاظ على القدرة على توليد أنواع الخلايا من سلالات مختلفة2 ،3،4. هذه النماذج تفتح إمكانية استجواب وظيفة الجينات، وفهم كيف ترتبط الطفرات المحددة والأنماط الظاهرية بأمراض مختلفة5،6. ومع ذلك، لفهم كيفية ربط تغيير معين إلى النمط الظاهري معين، واستخدام التحكم isogenic المقترنة وخطوط الخلايا متحولة من المهم للسيطرة على خط لتقلب خط7،8. وقد استخدمت النوكلورات الشبيهة بالمنشطات والزنك لتوليد طفرات الإدراج أو الحذف (indels) في نماذج وراثية متنوعة، بما في ذلك الخلايا الأولية؛ ولكن هذه nucleases يمكن أن تكون مرهقة للاستخدام ومكلفة10،11،12،13،14. وقد أحدث اكتشاف تكرار قصير متباعد (CRISPR)-CAS9 nuclease متفاوتة في الميدان بسبب الكفاءة في تكوين الإندل في أي منطقة من الجينوم تقريبا، وبساطة الاستخدام، وخفض التكلفة15 , 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19.

وكان التحدي في استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم القائم على CRISPR-CAS9 توليد أو تصحيح طفرات محددة في أليل واحد دون خلق طفرة indel في الأليل الثاني20. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو التغلب على هذا التحدي باستخدام اثنين من قوالب إصلاح oligonucleotide واحد الذين تقطعت بهم السبل (ssODN) للحد من تشكيل الإندل في الأليل الثاني. تم تصميم كل من ssODNs لاحتواء الطفرات الصامتة لمنع إعادة قطع من قبل NUcLEASE CAS9، ولكن واحد فقط يحتوي على تغيير الفائدة. هذا الأسلوب يزيد من كفاءة توليد تعديل وراثي غير متجانسة دون تحفيز تشكيل indel في الأليل الثاني. باستخدام هذا البروتوكول، تظهر تجارب تحرير الجينات في ستة مواقع جينية مستقلة الإدخال الدقيق للتغيير الجيني المطلوب في الأليل واحد دون تشكيل الإندل في الأليل الثاني ويحدث مع كفاءة عامة من ~ 10٪. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوف من ماغواير وآخرون21.

Protocol

1. تصميم وبناء دليل RNA (gRNA) ملاحظة: يتكون كل gRNA من اثنين من 60 زوج قاعدة (BP) oligonucleotides التي يتم صلب لتوليد 100 نقطة أساس مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل (DS) oligonucleotide(الشكل 1A-C). الجدول الزمني لتصميم gRNA، وتوليد، واختبار كفاءة القطع هو ما يقرب من 2 أسابيع(?…

Representative Results

توليد الـ RNAs وفحص الإندلات سيتم استنساخ كل gRNA في متجه بلازميد ويعبر عنها باستخدام المروج U6. يتم استخدام إنزيم تقييد AflII لخطي بلازميد (#41824) ويقع بعد المروج U6. يتم استنساخ الفرقة 100 نقطة أساس التي تم إنشاؤها بعد صلب اثنين 60 نقطة أساس oligos في ناقلات التعبير gRNA باستخد?…

Discussion

في هذا البروتوكول، يظهر استخدام CRISPR-CAS9 جنبا إلى جنب مع اثنين من قوالب إصلاح ssODN لتوليد تغييرات محددة في الجينوم غير المتجانس أو المتجانس في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى. وقد أدى هذا الأسلوب إلى نجاح توليد خطوط الخلايا المسببة للسرطان التي تعبر عن التغيرات الجينية غير المتجانسة بك?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا البحث بتمويل من المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI)، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال المنح U01HL099656 (P.G. وD.L.F.) وU01HL134696 (P.G. و D.L.F.).

Materials

5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap Corning 352235
6-well polystyrene tissue culture dishes Corning 353046
AflII restriction endonuclease New England Biolabs R0520
Agarose VWR N605
DMEM/F12 medium ThermoFisher 11320033
dNTPs Roche 11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit Macherey-Nagel 740609
Gibson Assembly Kit New England Biolabs E2611
gRNA_Cloning Vector Addgene 41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent ThermoFisher (STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Corning 354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector Addgene 44719
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer New England Biolabs M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K210011
Proteinase K Qiagen Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells Takara 636763
SOC medium New England Biolabs B9020S
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher 12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) Tocris 1254

References

  1. Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
  2. Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
  5. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
  6. Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
  7. Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
  8. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  9. Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
  10. Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
  11. Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  12. Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
  13. Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
  14. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  15. Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
  16. Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
  17. Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
  18. Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
  19. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
  20. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  21. Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).

Play Video

Cite This Article
Cardenas-Diaz, F. L., Maguire, J. A., Gadue, P., French, D. L. Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60085, doi:10.3791/60085 (2019).

View Video