İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi
Summary
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA’nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken1,2 ,3,4. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunuanlarlar 5,6. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyojenik kontrol ve mutant hücre hatları nın kullanımı çizgi değişkenlik7için kontrol etmek önemlidir7 ,8. Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak nükleazları, birincil hücreler de dahil olmak üzere çeşitli genetik modellerde ekleme veya silme (indels) mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır; ama bu nükleazlar kullanmak için hantal olabilir ve pahalı9,10,11,12,13,14. Kümelenmiş düzenli olarak uzaylanmış kısa palindromik tekrarın (CRISPR)-CAS9 nükleazının keşfi, genomun hemen hemen her bölgesinde indel oluşumundaki verimlilik, kullanım kolaylığı ve maliyet15’teki azalma nedeniyle sahada devrim yarattı15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. yıl.
CRISPR-CAS9 tabanlı genom düzenleme teknolojisini kullanmanın zorluğu, ikinci alel20’deindel mutasyonu yaratmadan bir aleldeki spesifik mutasyonların oluşturulması veya düzeltilmesi olmuştur. Bu protokolün temel amacı, ikinci alelinin indel oluşumunu azaltmak için iki tek iplikli oligonükleotit (ssODN) onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmektir. Her iki ssODN’ler, CAS9 nükleazının yeniden kesilmesini önlemek için sessiz mutasyonlar içerecek şekilde tasarlanmıştır, ancak sadece bir tanesi ilgi nin değişimini içerir. Bu yöntem, ikinci alelinin indel oluşumunu indüklemeden belirli bir heterozigot genetik modifikasyon oluşturma nın verimliliğini artırır. Bu protokolü kullanarak, altı bağımsız genomik lokasyonda yapılan gen düzenleme deneyleri, ikinci alelde indel oluşumu olmadan bir alelde istenilen genomik değişimin kesin olarak ortaya çıkarılabilmeyi ve ~%10 genel verimlilikle meydana geldiğini göstermektedir. Açıklanan protokol Maguire ve ark.21uyarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, CRISPR-CAS9’un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10’a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, U01HL099656 (P.G. ve D.L.F.) ve U01HL134696 (P.G. ve D.L.F.) hibeleri yoluyla Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI), Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden fon la desteklenmiştir.
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
