Поколение определенных геномных модификаций с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека
Summary
Этот протокол предоставляет метод для облегчения генерации определенных гетерозиготных или гомозиготных изменений ядра с использованием CRISPR-CAS9 в стволовых клетках человека.
Abstract
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки предлагают мощную систему для изучения функции генов и моделирования конкретных мутаций, имеющих отношение к болезни. Генерация точных гетерозиготных генетических модификаций является сложной задачей из-за CRISPR-CAS9 опосредованного индель образования во втором аллеле. Здесь мы демонстрируем протокол, помогающий преодолеть эту трудность, используя два шаблона ремонта, в которых только один выражает желаемое изменение последовательности, в то время как оба шаблона содержат молчаливые мутации, чтобы предотвратить повторное вырезание и образование indel. Эта методология является наиболее выгодным для редактирования генов кодирования регионов ДНК для создания изогенного контроля и мутантных линий стволовых клеток человека для изучения болезней человека и биологии. Кроме того, была проведена оптимизация методологий трансфекции и скрининга для снижения рабочей силы и затрат на эксперимент по редактированию генов. В целом, этот протокол широко применим ко многим проектам редактирования генома, используя модель стволовых клеток человека.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются ценными инструментами для моделирования болезни человека из-за их способности к обновлению, сохраняя при этом способность генерировать типы клеток различных линий1,2 ,3,4. Эти модели открывают возможность изыскнуть функцию генов и понять, как специфические мутации и фенотипы связаны с различными заболеваниями5,6. Однако, чтобы понять, как конкретное изменение связано с определенным фенотипом, использование парного изогенного контроля и мутантных клеточных линий важно контролировать для линии к линии изменчивости7,8. Транскрипционный активатор- как эффектиор нуклеазы (TALENs) и цинк палец нуклеазы были использованы для создания вставки или удаления (indels) мутации в различных генетических моделей, в том числе первичных клеток; но эти нуклеазы могут быть громоздкими в использовании и дорогими9,10,11,12,13,14. Открытие кластерных регулярно межпространственный короткий палиндромический повтор (CRISPR)-CAS9 нуклеаза произвела революцию в этой области из-за эффективности в формировании indel практически в любой области генома, простота использования, и снижение стоимости15 , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19.
Проблема в использовании технологии редактирования генома на основе CRISPR-CAS9 заключается в генерации или коррекции конкретных мутаций в одном аллеле без создания indel мутации во втором аллеле20. Основная цель этого протокола заключается в преодолении этой проблемы с помощью двух одноцепочечных шаблонов ремонта олигонуклеотида (ssODN) для уменьшения образования indel во втором аллеле. Оба ssODNs предназначены для сдерживания молчаливых мутаций, чтобы предотвратить повторное сокращение нуклеазой CAS9, но только один содержит изменение интереса. Этот метод повышает эффективность генерации специфической гетерозиготной генетической модификации без индуцирования во втором аллеле. Используя этот протокол, эксперименты по редактированию генов в шести независимых геномных местах демонстрируют точное введение желаемого геномного изменения в одном аллеле без образования indel во втором аллеле и происходит с общей эффективностью в 10%. Описанный протокол был адаптирован из Магуайр и др.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, использование CRISPR-CAS9 вместе с двумя шаблонами ремонта ssODN для создания конкретных гетерозиготных или гомозиготных изменений генома демонстрируется в стволовых клетках человека плюрипотентных. Этот метод привел к успешному генерации изогенных клеточных линий, выраж?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано финансированием из Национального института сердца, легких и крови (NHLBI), Национальных институтов здравоохранения через гранты U01HL099656 (P.G. и D.L.F.) и U01HL134696 (P.G. и D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
