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Genetics

Uso de células Drosophila S2 para imágenes en vivo de la división celular

Published: August 23, 2019
doi:
10.3791/60049
, ,
1Department of Biology,University of New Mexico

Summary

Las divisiones celulares se pueden visualizar en tiempo real utilizando proteínas etiquetadas fluorescentes y microscopía de lapso de tiempo. Utilizando el protocolo presentado aquí, los usuarios pueden analizar la dinámica de temporización de la división celular, el ensamblaje del husillo mitético y el congreso y la segregación cromosómica. Los defectos en estos eventos después de la inserción de ARN (ARN) pueden ser evaluados y cuantificados.

Abstract

Drosophila Las células S2 son una herramienta importante en el estudio de la mitosis en el cultivo de tejidos, proporcionando información molecular sobre este proceso celular fundamental de una manera rápida y de alto rendimiento. Las células S2 han demostrado ser susceptibles de aplicaciones de imágenes de células fijas y vivas. En particular, las imágenes de células vivas pueden producir información valiosa sobre cómo la pérdida o derribo de un gen puede afectar la cinética y la dinámica de eventos clave durante la división celular, incluyendo el ensamblaje del husillo mitótico, el congreso de cromosomas y la segregación, así como temporización general del ciclo celular. Aquí utilizamos las células S2 establemente transfectó con mCherry etiquetada fluorescentemente: -tubulina para marcar el husillo mitótico y GFP:CENP-A (denominado gen ‘CID’ en Drosophila) para marcar el centromere para analizar los efectos de los genes mitóticos clave en el momento de la sincronización de divisiones celulares, de la profase (específicamente en la descomposición del sobre nuclear; NEBD) hasta el inicio de la anafase. Este protocolo de imagen también permite la visualización del microtúbulo del husillo y la dinámica cromosómica a lo largo de la mitosis. En este documento, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo simple pero completo que permita a los lectores adaptar fácilmente las células S2 para experimentos de imágenes en vivo. Los resultados obtenidos de estos experimentos deben ampliar nuestra comprensión de los genes involucrados en la división celular definiendo su papel en varios eventos simultáneos y dinámicos. Las observaciones realizadas en este sistema de cultivo celular pueden ser validadas e investigadas in vivo utilizando el impresionante conjunto de herramientas de enfoques genéticos en moscas.

Introduction

La División Celular es un proceso crítico para todos losorganismos multicelulares, tanto en su desarrollo como en la homeostasis 1. Drosophila se ha utilizado durante mucho tiempo como un modelo para el estudio de la división celular, con experimentos en varios tipos de tejido y condiciones genéticas que proporcionan información clave sobre el proceso. Si bien muchos de estos conocimientos provienen de condiciones celulares fijas, la división celular es un procedimiento dinámico con muchas partes móviles, lo que hace que la visualización de células vivas sea integral para evaluar los efectos de RNAi o nocaut sordo genéticos en numerosas partes de la división celular, incluyendo formación de husillo, el cromosoma congresión y la segregación, y la citoquinesis.

Muchos protocolos se han desarrollado y utilizado a lo largo de los años para visualizar las divisiones celulares de Drosophila in vivo. Varios grupos han cultivado técnicas para la imagen de divisiones tanto en discos imaginales larvales como en cerebros larvarios2,3,4,5,6,7,8 . Estas técnicas, si bien son útiles para la toma de imágenes en tejidos específicos, son limitadas en el rendimiento y a menudo requieren la generación y el mantenimiento de las existencias genéticas para generar componentes fluorescentes y alterar la expresión de genes de interés. Las células S2 cultivadas de Drosophila proporcionan una alternativa de mayor rendimiento para probar rápidamente los efectos de varios genes en la división celular. Además, con la capacidad de transfectar varias proteínas fluorescentes, las células S2 se pueden modificar rápidamente para determinar los efectos del derribo de LOS ANI en numerosos componentes de la división celular. Los genes de interés con etiqueta fluorescente también se pueden observaren la división celular, lo que permite la caracterización dinámica de su función 9.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la toma de imágenes en vivo de células mitoticas S2 utilizando métodos que describimos recientemente10. Nuestro método utiliza células transtrampeadas establemente con marcadores fluorescentes para microtúbulos y centromeres cuya expresión está bajo el control de un promotor de cobre (metalotionina; pMT). Esta metodología se puede utilizar para tomar imágenes de la dinámica del husillo y del cromosoma en todas las fases de la mitosis utilizando un microscopio fluorescente relativamente simple con software de imagen básico. Se puede personalizar aún más para adaptarse a las necesidades individuales de investigación, con transfección transitoria y ARN ofrece nabi ampliando posibilidades para determinar el papel de los genes candidatos en la mitosis. Debido a la relativa simplicidad del protocolo, se puede utilizar para pantallas de pérdida de función a pequeña escala para identificar genes para los cuales el estudio adicional in vivo sería beneficioso, lo que permite esfuerzos más centrados y eficiencia con la posterior genética manipulación en moscas.

Protocol

1. Preparación de células S2 para el tratamiento con ARNi A partir de un cultivo de confluente pMT:GFP:CID y pMT:mCherry:-tubulina establemente transfectóa a las células S2 (80% viable; cultivadas a 24-28 oC), células de semillas en una placa de cultivo estéril de 6 pozos a una densidad de 1 x 106 células/ml en suero bovino fresco, caliente, 10% fetal (FBS) complementó los medios de insectos de Schneider (SIM).NOTA: Las células S2 transtornificadas por el estadisto se pueden generar siguiendo un protocolo del Drosophila RNAi Screening Center (DRSC) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells). Aunque la línea estable específica S2 utilizada aquí utiliza GFP y mCherry, existen numerosas alternativas tanto dentro de estos espectros fluorescentes como en otros. Una discusión detallada de estas proteínas fluorescentes está fuera del alcance de este protocolo, pero sus propiedades y posibles ventajas/desventajas han sido revisadas por expertos en otros lugares 11. Usando un contador de células o un hemocitómetro, determine la densidad del stock de células confluentes. Determinar el volumen de suspensión de células confluentes necesario para lograr 1 x 106 celdas/ml en un volumen total de 4 ml (por ejemplo, 4 x 106 celdas totales). Agregue este volumen de stock de celda a un volumen de SIM fresca para hacer un volumen total de 4 ml/bien. Determinar la densidad del material celular (células/ml) diluyendo 100 l de células directamente desde el matraz de stock con 100 s de medios y contando esta dilución 1:2 manualmente con un hemocitómetro o con un contador de celdas automático si está disponible.NOTA: Si se utilizan células S2 no transtrofificantes de forma estable, se puede realizar un ensayo transitorio de transfección con etiqueta fluorescente (GFP, mCherry, etc.) y un marcador de ADN (CENP-A, Histone H2B, etc.). Además, las líneas celulares transfectóte establemente con varios husillos mitoticos y marcadores de ADN están disponibles en el Centro de Recursos de Genética drosophila que pueden adaptarse mejor a las necesidades experimentales exactas del usuario (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog). Colocar las células recién sembradas en una incubadora de 24-28 oC durante 36-48 h. 2. Tratamiento de células sembradas con dsRNA contra genes de interés NOTA: El siguiente ejemplo y la sección Resultados utilizarán Shortstop (Shot), un agente reticulante de actina-microtúbulo como gen de interés. Utilice un tratamiento simulado sin dsRNA o con dsRNA dirigido contra un gen irrelevante (por ejemplo, beta-galactosidasa, lacZ)como control negativo. Los medios de insectos de Warm Schneider no se complementan con FBS (Medios libres de suero; SFM) en incubadora de 24-28 oC. Transfiera las células del pozo previamente sembrado (del paso 1.1.2) a un tubo estéril de 15 ml, observando el volumen total de las células transferidas. Conserve un pequeño volumen de células (-100 l) para contar en un contador de celdas o hemocitómetro. Células de pellets suavemente centrifugando a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Mientras que las células centrifugadoras, determinar la concentración de células por ml utilizando un contador de células o hemocitómetro. Multiplique este número por el volumen total que se está centrifugando (notado en 1.2.2.) para obtener el número total de celdas. Aspirar el sobrenadante de las células peletadas. Vuelva a suspender las células en SFM caliente para obtener una concentración de 3 x 106 células/ml. Transfiera 1 ml de las células resuspendidas a un nuevo pozo en una placa de 6 pocillos. Añadir 10-50 g de dsRNA (diluido en 100 l de agua libre de ARXase) contra Disparo (o el gen objetivo de interés) directamente a las células y girar la placa para mezclar. Incubar la placa durante 1 h en la incubadora de 24-28 oC para permitir la toma directa de dsRNA en las células. Durante la incubación de 1 h, calentar el 10% FBS suplementado SIM en la incubadora de 24-28 oC. Después de incubar las células con dsRNA durante 1 h, añadir 2 mL de 10 % FBS complementó SIM directamente al pozo sin quitar el 1 mL de medios. Coloque las células en una incubadora de 24-28 oC durante 3-7 días.NOTA: Al igual que con la concentración de dsRNA, el tiempo total de tratamiento puede necesitar ser optimizado para el gen objetivo deseado. Para evaluar la eficacia del ARNi, realice una mancha occidental en los licitados de células enteras utilizando un anticuerpo contra el gen diana. Si la secuencia de destino del dsRNA inicial resulta ineficaz, diseñar dsRNAs alternativos dirigidos a secuencias únicas dentro del gen objetivo. 3. Inducción de la expresión de proteínas fluorescentes y la preparación de células para imágenes Si se generaron células transtróficamente transestidas utilizando el plásmido pMT (que contiene un promotor inducible de metalotionina) como se describe aquí, inducir la expresión de proteínas fluorescentes mediante el tratamiento de células con sulfato de cobre (CuSO4) a una concentración final de 500 M durante 24-36 h antes de la toma de imágenes y 4 días después del tratamiento con ARNi. El uso de plásmidos de expresión constitutiva como pAct no requiere inducción de cobre. Preparar células para la creación de imágenes Calentar el 10% FBS complementado SIM en la incubadora de 24-28 oC durante 1 h. Transfiera las células a un tubo estéril de 15 ml, observando el volumen total de las células transferidas. Conserve un pequeño volumen de células (-100 l) para contar en un contador de celdas o hemocitómetro. Células de pellets suavemente centrifugando a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Mientras centrifugalas, determine la concentración (células/ml) utilizando un contador de células o un hemocitómetro. Multiplique este número por el volumen total que se está centrifugando (notado en 2.2.2.) para obtener el número total de celdas. Aspirar el sobrenadante de las células peletadas. Resuspenda las células en SIM suplementada fresca, calentada 10% FBS para obtener una concentración de 2 x 106 células/ml. Añadir una cantidad adecuada de CuSO4 para mantener una concentración de 500 M. Transfiera 200-500 l de células resuspendidas a un pozo de una cámara celular viva de varios pozos y colóquelas en el microscopio fluorescente invertido. Permita que las células se asienten en la cámara durante 15-30 minutos antes de los experimentos de diagnóstico por imágenes.NOTA: Los pozos de cámara de células vivas se pueden pre-revestir con poli-L-lisina para una adherencia adicional. 4. Configurar un programa de imágenes de células en vivo NOTA: Live Cell Imaging en este experimento se realizó utilizando un sistema de imágenes invertido y su software asociado (por ejemplo, Olympus IX83 con el paquete de software cellSens Dimensions). Los detalles variarán según el fabricante del microscopio y el paquete de software; por lo tanto, las directrices y operaciones generales se enumeran a continuación. Usando el software que ejecuta el microscopio fluorescente invertido, prepare un programa para tomar imágenes de una célula (o células) con el tiempo. Abra el software haciendo doble clic en el icono del escritorio del software. Cree un nuevo archivo experimental haciendo clic en Archivoy, a continuación, en Nuevo archivo experimental. En primer lugar, inserte un bucle de lapso de tiempo sobre qué imágenes se tomarán. Para ello, haga clic en el icono Cronómetro (icono de buclede lapso de tiempo) de la barra de iconos. Establezca el intervalo en s en la pestaña Administrador de experimentos y, a continuación, establezca el número de ciclos en la misma pestaña dividiendo la longitud total del experimento deseada (en s) por el intervalo. Permita que el bucle se repita durante el período de tiempo total deseado.NOTA: Típicamente, las imágenes se toman cada 30-60 s durante un período de 3-4 h. Dentro de la capa de bucle de lapso de tiempo, inserte una comprobación de enfoque infrarroja para mantener el enfoque del objetivo (si está disponible). Para ello, agregue un paso de Compensación de deriva Z (ZDC) dentro de la capa Time-lapse Loop haciendo clic en el icono Cuadrado con dos flechas (icono Mover XY) y seleccionando Compensación de deriva Z en el menú desplegable.NOTA: El término comprobación de enfoque infrarrojo se refiere a un sistema por el cual se utiliza un pulso infrarrojo para mantener una distancia constante entre el objetivo y la cámara de diapositivas/imágenes. Muchos microscopios tienen un sistema de este tipo, cada uno con su propia nomenclatura patentada. Los lectores deben consultar su manual de operación o representante para obtener detalles específicos sobre la nomenclatura. Después de la comprobación de enfoque infrarrojo, agregue un paso en el programa para tomar una imagen multicanal (por ejemplo, FITC para GFP y TRITC para mCherry) sobre una 3-5 pilas z insertando primero un paso de pila z y, a continuación, especificando el canal. Para ello, agregue una capa Multichannel Group dentro de la capa Time-lapse loop haciendo clic en el icono Rueda de color (iconoGrupo multicanal). A continuación, agregue una capa Z-Stack Loop dentro de la capa Multichannel Group haciendo clic en el icono de 3 capas (icono de bucle de pilaZ). Establezca el tamaño de paso y el número de sectores deseados en la pestaña Administrador de experimentos y establezca la exposición de cada canal lo más bajo posible para minimizar el fotoblanqueo.NOTA: El intervalo de la pila z, el tiempo de exposición y el porcentaje de transmisión de los LED pueden variar. Típico en estos experimentos, utilice tres pilas z tomadas en un rango de 3 m, dando un intervalo de 1 m entre cada pila. Definir el centro de la celda en lugar de la parte superior e inferior tiende a conducir a los mejores resultados. A continuación, se recopilan imágenes para cada canal o canales a una exposición de 50 ms y un porcentaje de transmisión del 50% sin filtro de densidad neutra (ND) activado. 5. Imagen que divide las células mediante el programa de imágenes de células vivas NOTA: Las células S2 no requieren CO2 y crecen de manera óptima a 23-27 oC. Todas las imágenes se realizaron a temperatura ambiente en una habitación bien controlada. Usando los oculares, encontrar la esquina superior (o inferior) del pozo y enfocar el objetivo (40-60x inmersión de aceite) en las células utilizando el canal mCherry (-tubulina). Escanee a lo largo de la parte superior (o inferior) del pozo para alejarse del divisor vertical del pozo.NOTA: Las imágenes demasiado cerca de los divisores de pozos pueden interferir con las comprobaciones de enfoque por infrarrojos. Encuentre una célula (o células) que estén en g2 tardío o en la fase M temprana (profase).NOTA: Estas células se pueden identificar mejor por la existencia de exactamente dos estructuras de microtúbulos ‘como estrellas’ (centrosomas) y un núcleo intacto (indicado por una región circular de luz refractada dentro de la célula), ambas fácilmente distinguidas usando el -tubulina (rojo) filtro de excitación. La selección de células en la interfase anterior, notable por uno o cero centrosomas fácilmente visibles, puede resultar en pérdida de tiempo debido a un retraso en la progresión G2/M. Por el contrario, la selección de células después de NEBD evitará un cálculo preciso de la sincronización mitotica y la toma de imágenes del conjunto del husillo temprano y la dinámica cromosómica. Además, las células S2 a menudo contienen >2 centrosomas. Aunque normalmente se agrupan en un husillo bipolar12,se recomienda que los usuarios eviten estas celdas a menos que se desee lo contrario para el diseño experimental. Las imágenes y la discusión de las celdas apropiadas para seleccionar se pueden encontrar en la sección Resultados representativos. Haga clic en el botón Vista en vivo para comenzar a ver las celdas en la pantalla del software. Usando la perilla de enfoque fino del microscopio, enfoque la célula (o células) de interés. Establezca la comprobación de enfoque infrarrojo haciendo clic en el botón Establecer enfoque. Inicie el programa de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en el botón Inicio. Ajuste los histogramas según sea necesario seleccionando el canal deseado y ajustando las intensidades medias de píxeles para ver claramente la celda (o celdas) de interés. Permita que el programa se ejecute, comprobando la celda después de 15-20 minutos para asegurar se ha producido la descomposición de la envolvente nuclear (NEBD), que está determinada por la desaparición de la oscuridad redonda, un punto refractado cerca del centro de la célula. Continúe permitiendo que el programa se ejecute, comprobando intermitentemente (cada 15-20 min) para determinar una vez que se ha producido el inicio de la anafase. Detenga el programa en este punto si queda más tiempo en el período de tiempo total y guarde el archivo. Alternativamente, si los eventos durante la telofase y la citoquinesis son de interés, permita que el programa funcione un tiempo suficiente para crear una imagen de estos procesos también. Realizar el análisis de NEBD a la sincronización de inicio de la anásica observando el tiempo de NEBD (tNEBD) en min y el tiempo de separación del cromosoma inicial (tinicio de la anafase)en min y restando tNEBD de tanafase onset para obtener el NEBD a la hora de inicio de la anafase para una célula dada. Para ello, haga clic en el botón marco hacia arriba y anote los fotogramas donde se producen nebd y inicio de anafase, restarlos para determinar el número total de fotogramas de lapso y multiplicarlo por el intervalo de tiempo entre los fotogramas de imagen. Continúe buscando celdas que se dividan previamente para obtener varias n’s para una condición dada. Las celdas se pueden tomar imágenes en la cámara celular viva bien hasta 12 h después de su asentamiento inicial.

Representative Results

Los métodos que describimos anteriormente darán lugar a la identificación e imágenes de células Drosophila S2 sometidas a división celular. Las células que están a punto de dividirse (es decir, justo antes de entrar en la fase M) pueden ser objetivo de la presencia de dos centrosomas y un núcleo intacto indicado por luz refractada y una mancha más oscura dentro de la célula cuando se ve en el canal de la tubulina (Figura1, paneles más a la izquierda, canal rojo; punta de flecha en la Figura 1A). Estimamos que aproximadamente 2-5% de las células entran en esta categoría, y entre experimentos de imágenes, por lo general pasamos un máximo de 2-3 minutos escaneando para otra célula calificada. NEBD se puede visualizar a través de la desaparición de esta mancha oscura, lo que resulta en la coloración uniforme del citoplasma (Figura1, paneles marcados “00:00”, rojo). Después de NEBD, el tiempo que tarda cada célula en formar el husillo, los cromosomas del congreso y los cromosomas segregados se puede medir simplemente observando los puntos de tiempo de estos eventos en relación con NEBD. Utilizamos estas divisiones para evaluar el cronometraje mitático, específicamente de NEBD a inicio de la anafase, señalando el punto en el que los cromosomas comienzan a separarse. Mayoría (90 %) células inducidas por cobre, expresadas tanto mCherry: -tubulina y GFP:CID. Un pequeño porcentaje de células (-10%) expresó sólo un marcador o ninguno. Estas células se evitaron durante la selección de la célula. Típicamente, las células S2 muestran NEBD a la sincronización de inicio de la anafase de entre 20-30 minutos (Figura1A,Control). A continuación tratamos las células con dsRNA dirigidas contra Shortstop (Shot), una proteína reticulante actina-microtúbula que sospechamos que puede afectar la dinámica del ciclo celular. De hecho, después de las células de derribo de Shot exhibió un retraso mitético significativo (Figura1B, Retardo ShotRNAi), con muchas células que se detienen en la metafase y nunca pasan a la anafase durante todo el experimento de imágenes de 2-3 horas (Figura1D, ShotRNAi). Razonamos que este fenotipo de retraso/detención podría deberse probablemente a la activación del punto de control del conjunto del husillo (es decir, el punto de control de la fase M). Para probar directamente esta hipótesis, co-tratamos células con dsRNA contra el trato de disparo y áspero (Rod), un componente importante de este punto de control13. Esto condujo a una supresión del fenotipo de detención, lo que resultó en NEBD a tiempos de anafase similares a Control (Figura1C, ShotRNAi+RodRNAi). Por lo tanto, este protocolo de imágenes en vivo nos permitió concluir que Shot es necesario para la progresión oportuna de la fase M y que su pérdida conduce a la activación del punto de control que retrasa o arresta las células mitoticas. Figura 1: Las imágenes en vivo revelan defectos del ciclo celular debido a la activación del punto de control mitético en las células S2.En todas las condiciones, se realizaron imágenes de células vivas en células S2 co-transpiradas establemente con GFP:CID y mCherry: -Tubulina como se describe en el presente documento. (A) Los dibujos animados ilustran puntos de referencia importantes durante la mitosis, y las imágenes correspondientes se muestran a partir de películas representativas de genotipos indicados con puntos de tiempo relativos a NEBD (t-00:00) indicados. Las células de control suelen progresar a la anafase dentro de 20-30min. Las células tratadas con ShotRNAi muestran retraso NEBD-anafase (B ) y con frecuencia se someten a detención metafásica, sin entrar nunca en la anafase dentro del experimento de imágenes (D). El cotratamiento de células con ShotRNAi y RodRNAi, un componente del punto de control del ensamblaje del husillo, suprime el fenotipo Shot que conduce a la cinética de inicio de la anafásica similar a las células de control (C). Las flechas en (A) indican las estructuras centrosomasas ‘como estrellas’, y la punta de flecha grande indica el núcleo. Cada barra de escala representa 5 micras. Esta figura se adapta y se vuelve a publicar con permiso de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Vídeo 1: Película de lapso de tiempo de la división de celdas S2 de ‘Control’. El vídeo muestra una película representativa de la división celular S2 en el genotipo ‘Control’. Esta película corresponde a la Figura 1A. Este vídeo se adapta y vuelve a publicar con permiso de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Haga clic aquí para descargar este video. Video 2: Película de lapso de tiempo de la división de células S2 de ‘ShotRNAi’ retrasada. El video muestra una película representativa de la división celular S2 en el genotipo ‘ShotRNAi’ que conduce a un retraso mitótico fenotípico. Esta película corresponde a la Figura 1B. Haga clic aquí para descargar este video. Video 3: Película de lapso de tiempo de la división celular S2 ‘ShotRNAi+RodRNAi’. El vídeo muestra una película representativa de la división celular S2 en el genotipo ‘ShotRNAi+RodRNAi’. Esta película corresponde a la Figura 1C. Este vídeo se adapta y vuelve a publicar con permiso de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Haga clic aquí para descargar este video. Video 4: Película de lapso de tiempo de la división de células S2 ‘ShotRNAi’ arrestada. El video muestra una película representativa de la división celular S2 en el genotipo ‘ShotRNAi’ que conduce a un arresto mitótico fenotípico. Esta película corresponde a la Figura 1D. Haga clic aquí para descargar este video.

Discussion

Identificación de una célula apropiada

La clave para la división de imágenes de las células S2 es localizar primero la célula adecuada. El tiempo puede ser el tiempo perdido células de imágenes que se cree erróneamente que están listas para dividirse, pero no lo hacen en un plazo razonable. Se deben identificar células que tengan dos centrosomas distintos y visibles y un núcleo intacto. Los centrosomas deben tener fibras de microtúbulos que emanan de ellos, dándoles un aspecto “estrellado”. Un núcleo intacto refracta la luz al ajustar el enfoque, y también hace que el centro aproximado de la célula sea más oscuro en apariencia. El núcleo también contendrá los “puntos” GFP:CID, otra característica distintiva para ayudar en su identificación. Se deben evitar las células con >2 centrosomas, puncta de tubulina sin fibras de tubulina que emanan de ellas, o células con un solo centrosoma. Además, si dos centrosomas son visibles, pero un núcleo no lo es, NEBD ya ha ocurrido y la célula está demasiado avanzada en su división para ser imagenda si se desea un análisis completo de la fase M. Una vez que se encuentra una célula adecuada, la velocidad en la toma de imágenes es crucial, ya que el NEBD se produce rápidamente (normalmente dentro de 3-5 min) y retrasar el inicio de la toma de imágenes puede provocar la pérdida de oportunidades. Enfoque la celda en el software de imágenes rápidamente de modo que ambos centrosomas sean visibles, o si los centrosomas están fuera de plano entre sí, establezca el punto focal entre los dos, de modo que cada uno se pueda capturar cuando se recogen pilas Z por encima y por debajo del centro definido Punto. Una vez enfocado, ajuste inmediatamente el desplazamiento entre el escenario y la superficie de la cámara celular viva utilizando la comprobación de enfoque infrarrojo (si está disponible) y comience el programa de imágenes. Aunque el protocolo presentado aquí está específicamente diseñado para experimentos que evalúan la dinámica de NEBD a anafásica, las modificaciones simples podrían adaptarse a los lectores que estudian eventos mitéticos alternativos. Para las imágenes DE NEBD a metafase y anafase a telofase, sugerimos intervalos de captura de imagen de 10 s, ya que estos procesos son altamente dinámicos y se producen rápidamente en las células S2 (5-10 min). La transición metafase-anafase (nuestro enfoque experimental típico) es un proceso más largo (20-30 min) en células S2, y recopilamos imágenes a intervalos de 30 s. Por último, la telofase a través de la citoquinesis se produce bastante lentamente en las células S2, y sugerimos intervalos de 60 s que proporcionen suficiente resolución para este proceso aproximado de una hora de duración.

Mantener el enfoque a lo largo del Programa de Imágenes

Si un dispositivo de verificación de enfoque infrarrojo no está disponible, asegúrese de evitar chocar el microscopio o la mesa sobre la que se asienta, ya que esto puede provocar que la célula se desenfoque durante el programa de imágenes, lo que dará lugar a resultados ambiguos e ininterpretables. Pre-recubrimiento de los pozos de la cámara celular viva con Poli-L-lisina puede ayudar en la adherencia celular, que puede ayudar a evitar el movimiento celular y es especialmente útil para configuraciones sin controles de enfoque infrarrojo. Además, las configuraciones que incluyen plataformas de absorción de impactos o mesas de aire pueden ayudar a evitar que las células se desenfoquen. Por último, algunos programas de software tienen funciones de pausa que permiten al usuario reenfocar y reanudar el programa.

Imágenes de múltiples células

La acumulación de datos es que a menudo se pueden colocar varias celdas listas para dividir dentro del mismo campo de visión para la creación de imágenes. Esto puede ser especialmente útil para experimentos en los que las células tienen duraciones largas en fase M o detención prolongada (por ejemplo, condiciones que inducen la activación del SAC). Para estas células, normalmente realizamos una imagen hasta que las células se fotoblanquean (aproximadamente 2-3 h), pero el tiempo completo de las células arrestadas debe ser a discreción del investigador. A veces, las múltiples celdas pre-dividiendo pueden estar en diferentes planos focales, en cuyo caso puede ser útil agregar pilas z para acomodar todas las celdas. Agregar más pilas z también puede ayudar a mejorar la resolución. Sin embargo, se debe tener cuidado al hacer esto, ya que expondrá las células a más radiación y conducirá a un fotoblanqueo más rápido, así como a grandes tamaños de archivo en los dispositivos de almacenamiento en disco duro.

Evitar el fotoblanqueo y la fototoxicidad

Nuestro método describe ajustes específicos para los tiempos de exposición, los intervalos de imágenes, las pilas z y el porcentaje de transmisión para nuestra fuente de luz LED que generalmente funcionan para nuestra configuración experimental y los resultados deseados. Como los microscopios y los objetivos experimentales pueden variar, lo que podría funcionar bien para nuestro sistema puede conducir a fotoblanqueo prematuro o fototoxicidad en otros. El fotodaño puede presentar una falta de movimiento del husillo, fragmentación del microtúbulo, dinámica de microtúbulos defectuoso y activación prolongada del punto de control del husillo. Un método potencial para evitar tales escollos es limitar el tiempo de exposición. La mayoría de las cámaras modernas ahora poseen amplios rangos dinámicos, y los histogramas se pueden ajustar para visualizar estructuras incluso con exposiciones muy bajas. Otra técnica consiste en aumentar el intervalo de imágenes (por ejemplo, a varios minutos entre imágenes) de modo que se reduzca el número de veces que una celda se expone a la luz durante un intervalo de recopilación total. Esto es ventajoso especialmente en imágenes durante períodos de tiempo más largos (muchas horas), y además puede ayudar a disminuir el tamaño del archivo de estos experimentos. Limitar el número de pilas z tomadas también puede ayudar a reducir la exposición a la luz, usando 2 o incluso sólo 1 en lugar de 3. Además, ajustar el porcentaje de transmitancia de la luz (para fuentes de luz LED), o utilizar filtros de densidad neutra (ND) (tanto para lámparas halógenas como para fuentes de luz LED) disminuirá la intensidad de la luz y junto con tiempos de exposición más largos puede preservar la visibilidad . Al elegir células con centrosomas ya separados, la exposición general puede ser limitada en el sentido de que estas células generalmente ingresan mitosis rápidamente (dentro de un minuto o dos) después de comenzar la toma de imágenes. También se puede limitar el tiempo que se permite que las celdas se crean imágenes antes de NEBD. Nuestro laboratorio normalmente establece este tiempo en 10 minutos, pero un límite más conservador puede ser impuesto fácilmente por el usuario. Además, una medida más “invasiva” que recomendamos es el tratamiento con dsRNA dirigido contra un componente del SAC (como Rod o Mad2). Si un fenotipo de detención se debe a daños celulares no específicos (por ejemplo, dinámica de microtúbulos defectuosos), es menos probable que dicho tratamiento suprima el arresto en comparación con un efecto de buena fe del gen de interés en el experimento original.

Direcciones futuras

El método descrito aquí se puede utilizar en un microscopio epifluorescente relativamente simple para crear rápidamente imágenes de divisiones celulares vivas y se puede adaptar fácilmente para adaptarse al diseño experimental y los objetivos particulares de un investigador. Se han publicado varios métodos excelentes para el cultivo, los enfoques de derribo de RNAi, la transfección transitoria y la microscopía de fluorescencia para S2 y otras células Drosophila 9,14,15, 16 , 17. Nuestro protocolo ofrece un par de ventajas. (1) El uso de una línea celular estable doble (GFP:CID, mCherry: -Tubulina) marca simultáneamente dos estructuras mitoticas clave, evita las molestias y posibles complicaciones de la transfección transitoria, y asegura que casi todas las células expresarán marcadores fluorescentes como candidatos potenciales para la toma de imágenes. (2) La adaptación a la mitosis se suma a los protocolos publicados que examinan la dinámica citoesquelética en células móviles y no divisorias y se extiende al examen de los eventos mitoticos en tiempo real. Si bien creemos que la nuestra es una técnica poderosa que se suma al repertorio de los demás, siempre puede haber mejoras realizadas. Un área particular de la división celular que hemos encontrado difícil de imaginar es la división centrosoma. Esto ocurre antes de NEBD y es difícil determinar cuándo un solo centrosoma está listo para separarse en dos. El uso de marcadores de ciclo celular fluorescente (Ciclina A y Ciclina B) podría ayudar a resolver este problema, pero viene a expensas de los canales que podrían utilizarse para visualizar los componentes de división celular. Nuestra mejor estrategia para intentar visualizar la división centrososoma es agregar adquisición multipunto al programa de imágenes (definir diferentes puntos en el plano XY a la imagen), pero esto puede resultar en archivos grandes, y también puede requerir (dependiendo del número de puntos) aumentar el intervalo entre la colección de imágenes, disminuyendo la resolución de tiempo de la película resultante. Otra solución podría ser la sincronización de células en una etapa de ciclo celular deseada utilizando medicamentos que apuntan a reguladores del ciclo celular seguidos de lavado posterior antes de la toma de imágenes, aunque estos métodos pueden no ser confiables en las células S2 específicamente.

El protocolo presentado aquí proporciona una base para futuras aplicaciones en imágenes de células en vivo también. Con una tecnología de imagen y software mejorada, podrían ser posibles adaptaciones de alto rendimiento de este protocolo utilizando placas multicámara de mayor capacidad. Tales innovaciones harían pantallas RNAi a gran escala, como las ya logradas en preparaciones fijas12,18,más manejables en un formato de celda en vivo. Las pantallas de fármacos de moléculas pequeñas también podrían concebirse como un medio para identificar nuevos compuestos dirigidos a los procesos de división celular. La mejora de los fluoróforos y los filtros ópticos también podría conducir a la toma de imágenes de múltiples componentes mitóticos (no solo los dos que describimos), lo que permitiría tomar imágenes de reguladores mitóticos específicos y sus interacciones con el ADN y/o el husillo. Por ejemplo, generar células con reporteros fluorescentes que se expresan después del daño del ADN o durante la apoptosis serían herramientas útiles para identificar nuevos genes involucrados en estos procesos. Se podrían utilizar enfoques similares para examinar la dinámica delciclo celular utilizando la expresión de ciclinas 19 etiquetadas fluorescentesmente.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM108756). Estamos agradecidos a Gary Karpen (Universidad de California, Berkeley) por proporcionarnos generosamente un stock de línea celular GFP:CID S2 a partir del cual nuestra línea GFP:CID/mCherry: -Tubulin se generó10.

Materials

Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check
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References

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Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).
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